Определение колиформных бактерий (БГКП).

Количество колиформных бактерий выражают в виде коли-титра или коли-индекса. Коли-титр воды – минимальное количество БГКП в 1 л воды. Коли-индекс воды – количество БГКП в 1 л воды.

Для определения этих показателей используют метод мембранных фильтров и титрационный (бродильный) метод.

Исследование воды методом мембранных фильтров. Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциально-диагностической среде и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим признакам.

Перед использованием мембранные фильтры проверяют на отсутствие трещин, отверстий, пузырей и кипятят в дистиллированной воде в течение 10 мин (при этом нельзя допускать скручивания фильтров). Для полного удаления из фильтров остатков растворителей, которые применяются при их изготовлении, кипячение следует повторить 3-5 раз со сменой дистиллированной воды. Подготовленные таким образом фильтры сохраняются в банках с дистиллированной водой или в сухом виде. В день постановки опыта фильтры повторно стерилизуют кипячением в дистиллированной воде в течение 10 мин.

Фильтрование производят с помощью специальных приборов или фильтра Зейтца. Перед посевом воды фильтровальный аппарат стерилизуют фламбированием после обтирания ватным тампоном, смоченным спиртом. После охлаждения на нижнюю часть фильтровального аппарата (столик) кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его верхней частью прибора (стаканом, воронкой) и закрепляют устройством, предусмотренным конструкцией прибора. Отросток колбы, в которую фильтруется вода, с помощью резиновой трубки соединяют с водоструйным или масляным насосом для создания вакуума в приемном сосуде (около 0,25 атм).

Объем пробы воды зависит от целей исследования. При анализе воды, поступающей в водопроводную сеть, и в наиболее характерных ее точках необходимо анализировать объем не менее 333 см³, профильтровывая этот объем не менее чем через два фильтра.

На этапах очистки анализируют не менее двух десятикратных объемов воды, выбранных в зависимости от ее качества таким образом, чтобы на

одном из фильтров вырастало не более 30 колоний бактерий группы кишечных палочек. При этом необходимо ориентироваться на результаты предыдущих анализов воды в этих же пунктах (например, для воды после первичного хлорирования могут быть выбраны объемы 10 и 100 см3; для воды необеззараженной - 0,1, 1 и 10 см³). При анализе воды неизвестного качества следует засевать 3-4 десятикратных объема (например, из водопроводной сети можно фильтровать 3; 30; 100; 200 см³ воды; по этапам

очистки - 0,1; 1; 10; 100 см³ воды).

Для фильтрования в воронку или стакан наливают необходимые объемы воды, начиная с меньших, а затем большие, каждый раз меняя фильтры. Самый меньший объем воды - 1 мл - следует фильтровать через фильтр, предварительно смоченный стерильной водой. После фильтрования верхнюю часть прибора снимают и фильтр осторожно (при сохранении вакуума для удаления излишка влаги на фильтре) стерильным пинцетом переносят на среду Эндо в чашку Петри. Фильтр накладывают вверх поверхностью, на которой осели бактерии, избегая появления пузырьков воздуха между фильтром и средой. На одну чашку можно разместить 4 фильтра, под каждым на дне чашки следует надписать объем воды, номер пробы и число.

Если вода мутная, то фильтрование ведется сразу через два фильтра: предварительный фильтр № 6 (для задержания крупных частиц) помещают на фильтр № 2. После фильтрования оба фильтра переносят на среду Эндо. Чашки с фильтрами помещают в термостат и инкубируют при температуре 37°С в течение 24 ч. При окончательном результате учитывают колонии, выросшие на обоих фильтрах.

При наличии в воде БГКП на фильтрах появляется рост типичных для этих бактерий колоний: темно-красные с металлическим блеском или красные, розовые с красным центром, имеющие четкий отпечаток на обратной стороне фильтра. Бактерии из таких колоний окрашивают по Граму и микроскопируют. С культурой грамотрицательных бактерий лактозополо-

жительных колоний ставят оксидазный тест для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от Pseudomonadaceae (последние являются оксидазообразующими бактериями). Для этого фильтр с выросшими на нем колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченной диметил-п-фенилендиамином. При наличии оксидазы реактив окрашивает колонию в синий цвет. 2-3 колонии, не изменившие окраску (оксидазоотрицательные) засевают в пробирку с полужидкой средой с 0,5% раствором глюкозы и инкубируют при 37°С. При появлении кислоты и газа результат считают положительным. Подсчитывают число красных колоний на фильтре и определяют коли-индекс.

Колииндекс (индекс ОКБ, БГКП) высчитывают следующим образом: количество бактерий группы кишечных палочек, выросших в анализируемом объеме воды, умножают на 1000 см³ и делят на этот объем воды.

К • 1000

индекс =              

V

где К- количество проверенных на принадлежность к ОКБ (БГКП) колоний на фильтрах;

V- объем профильтрованной воды через фильтры, на которых велся

учет.

 

 

Пример 1. При посеве трех объемов воды по 100 см³ на одном фильтре выросло три колонии бактерий группы кишечных палочек, на двух других нет роста; коли-индекс равен (3*1000):300 = 10.

Пример 2. При посеве 10 и 100 см³ воды на одном фильтре выросла одна колония, на другом выросло пять колоний; коли-индекс равен (6*1000):110 = 54.

Если на одном из фильтров сплошной рост бактерий и подсчет их невозможен, тогда в расчет принимают тот объем воды, при фильтровании которого на фильтре выросли изолированные колонии.

Для перевода индекса в титр используют формулу:

 

Титр =

1000

 

 

Индекс

 

 

В соответствии с ГОСТ, у воды питьевой индекс ОКБ должен быть не более 3, у воды плавательного бассейна - не более 10.

Метод мембранных фильтров является современным, точным, менее трудоемким и более дешевым в сравнении с титрационным методом. Он удобен и тем, что позволяет концентрировать бактерии, содержащиеся в значительном объеме воды на небольшой поверхности фильтра. Однако одним из самых существенных недостатков метода является то, что этим методом выявляется меньшее количество бактерий в сравнении с титрационным. Для большей точности рекомендуется исследование воды проводить параллельно обоими методами.

Титрационный метод исследования воды основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую питательную среду, с последующим пересевом на дифференциально-диагностическую среду и идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам. Объем засеваемой воды зависит от характера исследуемого объекта, но обязательно посев ведется в 2-3, а в некоторых случаях - в 5-ти повторностях. Объемы воды выбирают с таким расчетом, чтобы в одном из разбавлений получить хотя бы один отрицательный результат. При исследовании на этапах очистки и обеззараживания засевают 100; 10; 1 и 0,1 см³ воды;   на выходе в водопроводную сеть и в наиболее характерных ее точках засевают

три объема по 100 см³, три объема по 10 см³ и три объема по 1 см³.

Посев воды производится в глюкозопептонную среду (1% пептонная вода, 0,5% раствор глюкозы, 0,5% раствор хлорида натрия, индикатор Андреде, поплавок). Для посевов больших объемов воды используют концентрированную среду, содержащую 10-кратные количества указанных веществ. Так, посев 100 мл воды производят в 10 мл концентрированной

среды, 50 мл - в 15 мл концентрированной среды, 10 мл - в 1 мл концентрированной среды; 1 мл и последующие разведения - в 10 мл глюкозопептонной среды нормальной концентрации. Большие объемы воды засеваются во флаконы или колбы, меньшие - в пробирки. Посевы инкубируют в термостате в течение суток при температуре 37°С.

Из пробирок с посевами, в которых наблюдается помутнение (а также образование кислоты и газа в поплавке), делают высев петлей штрихами на поверхность среды Эндо, разделенной на 3-4 сектора. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 16-18 ч. При наличии на среде Эндо характерных для БГКП колоний (красных с металлическим блеском) следует провести все тесты, перечисленные выше. Положительный ответ на наличие БГКП дается в том случае, если наблюдается рост характерных колоний, образованных оксидазоотрицательными, Гр(-) бактериями, сбраживающих глюкозу при 37°С с образованием кислоты и газа. Таким образом, положительный ответ выдается через 40—42 ч.

Результат выражается в виде индекса (титра) БГКП, цифровое выражение которого определяют по таблицам: при анализе питьевой воды на выходе в водопроводную сеть и из нее – по табл. 5 и 6; при анализе воды на этапах очистки и обеззараживания – по табл. 7.

Таблица 5. Определение индекса БГКП при исследовании 300 см³

воды.

 

Количество положительных результатов анализа воды из:			Коли- индекс	Пределы индекса (доверительные границы)		Коли- титр
трех флаконов по 100 см3	трех пробирок по 10 см3	трех пробирок по 1 см3		нижний	верхний
0	0	0	Менее 3	-	-	Более 333
0	0	1	3	0,5	9	333
0	1	0	3	0,5	13	333
1	0	0	4	0,5	20	250
1	0	1	7	1	21	143
1	1	0	7	1	23	143
1	1	1	11	3	36	91

1	2	0	11	3	36	91
2	0	0	9	1	36	111
2	0	1	14	3	37	72
2	1	0	15	3	44	67
2	1	1	20	7	89	50
2	2	0	21	4	47	48
2	2	1	28	10	149	86
3	0	0	23	4	120	43
3	0	1	39	7	130	26
3	0	2	64	15	379	16
3	1	0	43	7	210	23
3	1	1	75	14	230	13
3	1	2	120	30	380	8
3	2	0	93	15	380	11
3	2	1	150	30	440	7
3	2	2	210	35	470	5
3	3	0	240	36	1300	4
3	3	1	460	71	2400	2
3	3	2	1100	150	4800	0,9
3	3	3	Более110 0	-	-	Менее 0,9

 

Таблица 6. Определение коли-индекса БГКП при исследовании 500 см³

воды.

 

Количество положительных результатов анализа воды из пяти флаконов по 100 см3	Коли- индекс	Пределы индекса (доверительные границы)		Коли-титр
		нижний	верхний
0	Менее 2	0	6,0	Более 455
1	2	0,1	12,6	455
2	5	0,5	19,2	196
3	9	1,6	29,4	109
4	16	3,3	52,9	62
5	Более 16	8,0	-	Менее 62

 

Таблица 7. Определение индекса БГКП при исследовании воды по этапам очистки.

Объем исследуемой воды, см3				Коли-индекс	Коли-титр
100	10	1,0	0,1
-	-	-	-	Менее 9	Более 111
-	-	+	-	9	111
-	+	-	-	10	105

+	-	-	-	23	43
+	-	+	-	94	10
+	+	-	-	230	4
+	+	-	+	960	1
+	+	+	-	2380	0,4
+	+	+	+	Более 2380	Менее 0,4

 

Определение термотолерантных колиформных бактерий (ТКБ)

ТКБ определяют теми же методами, как и БГКП, кроме последнего этапа идентификации, который проводится по ферментации лактозы на полужидкой питательной среде при 44,5°С. В случае роста на среде Эндо типичных лактозоположительных колоний, Гр(-), оксидазоотрицательных, способных ферментировать лактозу при 44,5°С, их учитывают как ТКБ, индекс или титр определяют по таблице 6.

Определение колифагов.

Присутствие колифагов (бактериофагов, паразитирующих на Е. coli) определяют методом агаровых слоев по Грациа.

Для определения используют чувствительные музейные культуры микроорганизмов (тест-организмы): мутант Salmonella tuphimurium, непатогенный для человека, штамм Escherichia coli К-12 Hfr из соответствующей коллекции культур АТСС 23631 или NTCT12486, штамм E.coli рода CN, называемый WG5, а также бактериофаги MS2, NCTC12487 или АТСС 15597 для контроля чувствительности тест-организмов.

За 18-24 часа перед проведением анализа необходимо сделать посев тест-культуры E.coli К₁₂ F+ на скошенный питательный агар (МПА). Перед проведением анализа сделать смыв с «косяка» 5 мл стерильной водопроводной воды и по стандарту мутности приготовить взвесь тест- организма в концентрации 10⁹ бакт. клеток/мл.

Расплавить и остудить до 45°С 2%-ный питательный агар. Исследуемую воду 100 мл внести в 5 стерильных чашек Петри (по 20 мл в каждую). В питательную среду добавить смыв E.coli (из расчета 1 мл на 100 мл агара) и хорошо перемешать. Полученной смесью залить по 30 мл сначала

пустую чашку Петри (контроль), а затем все чашки, содержащие исследуемую воду. Содержимое чашек перемешивают вращательными движениями. После застывания питательной среды чашки переворачивают вверх дном и ставят для инкубирования в термостат при 37°С на 18-24 ч.

В результате индикаторная культура образует равномерный сплошной рост, а при наличии колифагов в этом «газоне» образуются прозрачные бляшки («негативные колонии» бактериофага). Учет результатов проводят путем подсчета и суммирования бляшек, выросших на 5-ти чашкках Петри. Результаты выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 100 мл воды. В контрольной пробе бляшки должны отсутствовать.

Определение спор сульфитредуцирующих клостридий.

Испытуемую воду вносят в расплавленную и остуженную среду Вильсона—Блера. Среда содержит тиосульфат (гипосульфит) и бесцветную соль железа. В результате прорастания спор, размножения клостридий и восстановления ими сульфита образуется сульфид железа, который придает среде черный цвет.

Количественно эти микроорганизмы в воде можно определить методом мембранной фильтрации или прямым посевом.

Перед посевом пробу воды прогревают на водяной бане при температуре 75±5°С в течение 15 мин для уничтожения вегетативных форм. При исследовании хлорированной воды, ее можно не прогревать. Применяя метод мембранной фильтрации, пробу воды определенного объема пропускают через фильтр, который затем помещается в пробирку с подготовленной расплавленной питательной средой верхней стороной внутрь (пробирка с питательной средой после посева должна быть немедленно охлаждена в холодной воде во избежание попадания воздуха) или в чашку Петри на поверхность питательной среды, которая затем заливается той же питательной средой толстым слоем.

Метод прямого посева предполагает посев в стерильные пробирки 20 мл воды следующим образом: по 10 мл в 2 пробирки (объемом не менее 30 мл), или по 5 мл в 4 пробирки (объемом не менее 15 мл).

Сверху посевы воды заливают горячим (75-80°С) железосульфитным агаром в количестве, превышающем объем воды в 2 раза. Среду заливают по стенке пробирки, стараясь не допустить образования пузырьков воздуха. Пробирки с посевами быстро охлаждают в стакане с холодной водой, инкубируют при 44°С в течение 24 ч.

Количественному учету подлежат только те посевы, где получены изолированные колонии. Подсчитывают черные колонии, выросшие как на фильтре, так и в толще питательной среды. Результат анализа выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) спор сульфит-редуцирующих клостридий в определенном объеме воды (подвергнутой анализу).

6. Санитарно-микробиологическое исследование почвы.

Микрофлора почвы.

Почва состоит из минеральных и органических соединений. Она – продукт жизнедеятельности микроорганизмов, осуществляющих процесс её формирования, самоочищения, круговорота азота, углерода, серы и железа в природе. Микроорганизмы почвы фиксируют азот из воздуха (около 100 млн т ежегодно), образуют гумус почвы и высвобождают питательные вещества для растений, выполняют санитарную функцию почвы. Почва является основной средой обитания многих микробов. Отсюда они поступают в воду и обсеменяют воздух.

Микрофлора почвы включает все известные группа микроорганизмов: споровые и неспорообразующие бактерии, актиномицеты, грибы, спирохеты, архебактерии, простейшие, сине-зеленые водоросли, микоплазмы и вирусы. В 1 г почвы насчитывается до 6 млрд микробных тел.

Очаговость распространения микроорганизмов – главная особенность их экологии в почве, позволяющая сохранить виды почвенных

микроорганизмов и специфичность группировок по горизонтам почвы. В верхних слоях обитают актиномицеты и аэробы. В нижних – грибы и анаэробы. Количественный состав микроорганизмов почвы неравномерен. Самый поверхностный слой толщиной 1—2 мм содержит мало микроорганизмов, так как они быстро погибают под действием солнечных лучей и высыхания. Следующий слой, глубиной 10—20 см, наиболее обсеменен разнообразными микроорганизмами, под влиянием которых в нем протекают бурные биохимические процессы. По мере увеличения глубины количество микробов постепенно уменьшается, но их обнаруживают даже на значительной глубине. Независимо от глубины наиболее густо всегда заселена околокорневая (ризосферная) зона растений. Качественный состав околокорневой микрофлоры зависит от вида растений, но во всех случаях преобладает грибная флора. Количество микроорганизмов околокорневой зоны в тысячи раз превышает микробное число не занятой растениями почвы. Этот факт используется при обезвреживании почвы, обсемененной патогенными бактериями.

На качественный и количественный состав микрофлоры почвы влияет тип почвы, её плодородие, влажность, аэрация и физико–химические свойства. На микробиоценоз почвы существенно влияет деятельность человека: обработка почвы, внесение удобрений, мелиорация, загрязнение отходами производств.

Патогенные микроорганизмы могут попасть в почву с выделениями человека и животных. Особо опасным в санитарном отношении является загрязнение почвы необезвреженными отходами животноводства (навоз, моча, трупы животных). Самоочищающая способность почвы ограничена, а методы обеззараживания почвы громоздки и малоэффективны (например, 5 кг хлорной извести на 1 м³ почвы).

Патогенные для человека микроорганизмы можно разделить на три группы.

К первой группе относятся патогенные микробы, для которых почва является постоянным местом обитания. Это возбудители ботулизма, актиномицеты, грибы, вызывающие микозы.

Вторая группа представлена споровыми микроорганизмами, для которых почва является вторичным резервуаром, где они сохраняются длительное время (десятилетия). К ним относятся возбудители сибирской язвы, столбняка и газовой гангрены.

Третья группа — патогенные микробы и вирусы, которые, попадая в почву с выделениями человека и животных, сохраняются там от нескольких часов до нескольких месяцев (кишечная палочка, сальмонеллы, шигеллы). Опасность передачи через почву заболеваний, вызванных этими возбудителями, невелика и зависит от интенсивности обсеменения микробами.

Исследование почвы.

Санитарно-микробиологическое исследование почвы необходимо для выявления и предотвращения распространения возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных.

Исследование почвы можно разделить на предупредительный и текущий санитарный надзор.

Предупредительный надзор осуществляют:

а) при планировке, строительстве и реконструкции вновь заселяемых участков и населенных мест;

б) при выборе участков для строительства лечебно-профилактических и аптечных учреждений, санаториев, детских учреждений;

в) при решении вопросов водоснабжения и канализации населенных территорий;

г) при санитарной оценке пляжей, мест коллективного отдыха и т.д. Текущий санитарный надзор осуществляют:

а) при оценке санитарного состояния почвы и ее способности к самоочищению после загрязнений (например, почву детских садов, больниц, зон отдыха исследуют 2 раза в год);

б) при контроле за почвенными и биотермическими методами обезвреживания сточных вод и отбросов (1—4 раза в месяц);

в) по эпидемическим показаниям для выяснения возможного пути передачи инфекционных заболеваний.

При осуществлении текущего санитарного надзора рекомендуется сокращенный анализ. Он включает: определение ОМЧ, БГКП, титра строгих анаэробов, термофильных бактерий, нитрифицирующих бактерий. В полный санитарно-микробиологический анализ дополнительно входят: определение численности и процентного отношения спор к общему количеству микроорганизмов,       количество        актиномицетов,        грибов, целлюлозоразрушающих микроорганизмов и аммонификаторов, основных групп почвенного микробиоценоза и ряд дополнительных исследований (например, токсичность почв для микроорганизмов). По эпидемическим показаниям в ходе исследований проводят обнаружение патогенных микроорганизмов: сальмонелл, шигелл, возбудителя сибирской язвы, патогенных клостридий.