Гематологический Научный Центр

Гематологический Научный Центр

НПО “РЕНАМ ”

Москва, Новый Зыковский пр., д. 4а

 

Пособие для врачей-лаборантов

По методам исследования

Плазменного гемостаза

ПРОТИВОСВЕРТЫВАЮЩАЯ СИСТЕМА,

СИСТЕМА ФИБРИНОЛИЗА

Москва, 2006 г.

Составители:

 

Генеральный директор НПО «РЕНАМ», доктор биологических наук Козлов Альберт Анатольевич

 

зав. производством НПО «РЕНАМ», старший научный сотрудник, кандидат биологических наук Берковский Арон Леонидович

 

начальник ОТК НПО «РЕНАМ», старший научный сотрудник, кандидат биологических наук Качалова Наталья Дмитриевна

 

научный сотрудник НПО «РЕНАМ» Сергеева Елена Владимировна

 

ведущий научный сотрудник ГНЦ РАМН, кандидат биологических наук Простакова Татьяна Михапйловна

 

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ_ 4

АНТИТРОМБИН III 4

Абильдгаард АТ III-тест.  Клоттинговый метод Абильдгаард, первоначальный вариант 6

РеаКлот – АТIII тест. Клоттинговый метод Абильдгаард, упрощенный метод_ 7

РеаХром-АТIII тест Набор реагентов для определения активности антитромбина III фотометрическим методом_ 7

Интерпретация результатов_ 8

Аналитические характеристики наборов_ 8

СИСТЕМА ПРОТЕИНА С_ 9

Протеин С тест Набор реагентов для определения общей активности системы протеина С 11

Аналитические характеристики набора 12

Порядок применения 12

Интерпретация результатов_ 13

РеаХром-Протеин С тест Набор реагентов для определения активности протеина С фотометрическим методом_ 13

Аналитические характеристики набора 13

РеаРrC/FV тест Набор реагентов для определения резистентности активированного фактора V к протеину C_ 14

Интерпретация результатов_ 14

ГЕПАРИН И ГЕПАРИНОТЕРАПИЯ_ 14

РеаХром Гепарин  Набор реагентов для определения анти-Xa активности гепарина фотометрическим методом_ 16

Аналитические характеристики набора 17

РеаКлот-Гепарин Набор реагентов для определения анти Ха активности гепарина коагулологическим методом_ 17

Интерпретация результатов. 18

Плазма-калибратор (3 уровня активности гепарина) 18

Плазма контрольная (2 уровня активности гепарина) 18

ФИБРИНОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ КРОВИ_ 19

XIIa-зависимый фибринолиз Набор реагентов для определения фибринолитической активности плазмы крови человека_ 20

Интерпретация результатов анализа 20

Плазминоген_ 21

РеаХром-Плазминоген Набор реагентов для определения активности плазминогена фотометрическим методом_ 22

Интерпретация полученных результатов_ 22

Набор реагентов для определения растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК) в плазме крови фенантролиновым методом (РФМК-тест) 22

Интерпретация результатов_ 23

Литература_ 23

 

ВВЕДЕНИЕ

Процесс образования сгустков фибрина должен быть ограничен местом повреждения и не распространяться по организму. Для этого существуют специальные протеины, которые связываю и инактивируют сериновые протеазы коагуляционного каскада. Поэтому в ходе нормального гемостаза только небольшие количества факторов свёртывания в плазме превращается в активные протеазы или кофакторы. Скорость и степень генерации сериновых протеаз регулируется группой ингибиторов, протеинов, которые функционируют как природные антикоагулянты. Природные антикоагулянты позволяют локализовать свёртывание в месте повреждения и предупредить превращение процесса в системный. Этими природными антикоагулянтами в первую очередь являются антитромбин III и система протеина С.

Физиологический инактиватор тромбина – антитромбин III, образующий комплекс тромбин-антитромбин, в присутствии гепарина способен инактивировать до 60% тромбина в плазме, оставшееся количество инактивируется менее специфическими ингибиторами (α2 макроглобулин). Когда тромбин удаляется с места повреждения, он связывается с тромбомодулином на поверхности эндотелиальных клеток и теряет способность превращать фибриноген в фибрин. Комплекс тромбин-тромбомодулин активирует систему протеина С, которая инактивирует факторы VIIIa и Va, чем полностью блокирует свертывание. Система протеина С в свою очередь активирует систему фибринолиза, предназначенную для растворения образовавшихся сгустков фибрина.

АНТИТРОМБИН III

Одним из важнейших белков противосвертывающей системы является антитромбин III, который вместе с протеином С и некоторыми другими ингибиторами является главным регулятором гемостатического механизма. Антитромбин III - это D белок с молекулярной массой 60 000, который является членом семейства серпиновых или сериновых протеиназных ингибиторов, синтезируемых в печени, и связывающихся с инактивируемыми сериновыми протеазами через каскад свёртывания.

Хотя название «антитромбин» обусловлено взаимодействием с тромбином, антитромбин III также инактивирует факторы XIIa, XIa, Xa и IXa путём связывания с сериновыми остатками активных центров этих протеаз.

Кинетика взаимодействия может быть ускорена во много раз добавлением гепарина. Гепарин связывается с центрами антитромбина III, которые отличаются от региона, связывающего протеазы, и действует как аллостерический регулятор. После образования комплекса протеазы с антитромбином III гепарин высвобождается и может связываться с другими молекулами антитромбина III. Такое «каталитическое» ускорение активности антитромбина III гепарином названо гепарин-кофакторной активностью, которая требуется для полного антикоагулянтного действия гепарина в плазме.

В ходе нормального гемостаза антитромбин III активируется путём связывания с гепариноподобными гликозаминогликанами (гепаранами), находящимися на поверхности эндотелиальных клеток.

Антитромбин III - ингибитор всех сериновых протеаз, вовлеченных в процесс свертывания крови. Физиологическое значение антитромбина III подтверждает выраженная тенденция к тромбоэмболиям при врожденном дефиците ингибитора, встречающаяся в популяции с частотой 1: 5 000. Выделены 3 типа врожденного дефицита антитромбина III: снижение концентрации и функциональной активности, снижение только функциональной активности при нормальном содержании ингибитора, снижение только гепарин-кофакторной активности при нормальной активности и концентрации. Причинами приобретенного дефицита антитромбина III являются: снижение синтеза, пассивная потеря с биологическими жидкостями при кровопотере и повышенной сосудистой проницаемости, снижение за счет потребления при активации свертываюшей системы. Уменьшение синтеза антитромбина III отмечено при заболеваниях печени.

В 1982 г было показано, что при всех формах дефицита антитромбина III возникает ДВС - синдром. Лечение и предупреждение дефицита антитромбина III возможно введением свежезамороженной плазмы. Однако при этом пациенту следует ввести не менее 1,0 л свежезамороженной плазмы, что не всегда показано из-за риска возникновения недостаточности почек, сердца, отека легких. В этом случае лиофильно высушенный концентрат антитромбина III является препаратом выбора. Диагностические наборы для определения активности антитромбина III в плазме крови и в концентратах лечебного препарата – антитромбина III являются чрезвычайно актуальными и в нашей стране до последнего времени не производились.

В настоящее время расшифрована первичная структура многих ферментов, что позволило искусственно синтезировать пептиды с аминокислотной последовательностью, аналогичной участкам субстратов, расщепляемых тромбином, плазмином и другими ферментами свертывающей системы крови. Сериновые протеазы свертывающей системы обладают достаточно узкой специфичностью в отношении белковых субстратов. Поэтому удалось синтезировать достаточно простые пептиды-субстраты и присоединить к конечным аминокислотным группам этих пептидов различные красители. Когда синтетический пептид (названный хромогенным субстратом) взаимодействует со специфическим ферментом, краситель высвобождается, и его количество можно измерить фотометрически. Таким образом, с помощью хромогенных субстратов можно измерить активность многих протеаз, участвующих в свертывании крови.

Особенно часто этот метод применяется для определения активности антитромбина III. Следует помнить, что измерение амидолитической активности не является прямым измерением биологической активности факторов свертывания. Однако из-за простоты выполнения анализа амидолитические методы с применением хромогенных субстратов получили широкое применение в лабораторно-диагностических исследованиях.

Для определения антитромбина III в плазме крови существуют много различных методов, преимущественно основанных на применении хромогенных субстратов.

Компания РЕНАМ представляет 3 метода определения активности антитромбина III: клоттинговый метод Абильдгаард в двух модификациях и метод с хромогенным субстратом.

Плазмы-калибраторы, входящие в состав наборов компании «РЕНАМ», аттестуются по зарубежным стандартным плазмам производства ведущих мировых фирм (Dade-Behring).

Абильдгаард АТ III-тест.
Клоттинговый метод Абильдгаард, первоначальный вариант

Принцип метода.

Оценку активности антитромбина III в исследуемой плазме проводят по остаточной активности тромбина после его взаимодействия с антитромбином III в дефибринированной плазме.

Определение активности антикоагулянта проводят по калибровочному графику, в котором время образования сгустка фибрина прямо пропорционально активности антитромбина III. Процесс стандартизуется проведением реакции при постоянной температуре (37°С).

В тесте участвуют 3 плазмы: исследуемая (дефибринируется), плазма-калибратор с аттестованной активностью антитромбина III (дефибринируется) и фибриноген-плазма (в набор не входит, можно использовать любую плазму), являющаяся источником фибриногена.

В исследуемой плазме крови тепловой обработкой удаляют фибриноген, вносят стандартное количество тромбина, содержащего инактиватор гепарина, смесь инкубируют и затем определяют в ней остаточную (после взаимодействия с антитромбином III) активность тромбина. Чем активнее антитромбин III в исследуемой плазме, тем меньше остаточная активность тромбина, и тем медленнее происходит образование сгустка.

РеаКлот – АТIII тест.
Клоттинговый метод Абильдгаард, упрощенный метод

Принцип метода.

Определяется остаточная активность тромбина после взаимодействия с антитромбином III.

Возможное присутствие в исследуемой плазме гепарина (до 1 МЕ/мл) не влияет на измерение активности антитромбмна III благодаря присутствию в тромбине инактиватора гепарина. В отличие от первоначального варианта в состав набора включен усовершенствованный реагент тромбина, не требующий стабилизатора, а также специально приготовленный реагент фибриногена. Этот метод более прост по сравнению с первоначальным вариантом.

 

РеаХром-АТIII тест
Набор реагентов для определения активности антитромбина III
фотометрическим методом

Принцип метода.

Метод основан на способности антикоагулянта нейтрализовать тромбин в присутствии гепарина. Активность антитромбина III определяют в недефибринированной плазме, добавляя к ней избыток тромбина. При этом происходит ингибирование тромбина комплексом антитромбин III-гепарин пропорционально количеству антитромбина III в плазме. Оставшееся количество тромбина катализирует отщепление пара-нитроанилина (р NА) от синтетического хромогенного субстрата.

Абсорбция свободного pNA, определяемая при 405 нм, обратно пропорциональна активности антитромбина III.

Процесс идет по следующей схеме:

АТIII + гепарин (избыток) Þ АТIII-гепарин.

АТIII-гепарин + тромбин (избыток) Þ АТIII-гепарин-тромбин + тромбин (остаток).

Субстрат-рNA + тромбин (остаток) Þ Пептид + рNA.

 

Код	Наименование, состав набора, краткое описание	Число анализов
ПФА-1	Абильдгаард АТ III-тест. Исследование антитромбина III клоттинговым методом Абильдгаард. Состав: - тромбин, лиофильно высушенный (1,0 мл) - 3 фл., - плазма-калибратор, лиофильно высушенная (1,0 мл) – 1 фл., - концентрат имидазолового буфера (5,0 мл) – 1 фл., - стабилизатор (1,0 мл) – 1 фл.	90
ПФА-2	РеаХром АТ III-тест. Исследование антитромбина III фотометрическим методом. Состав: - тромбин, лиофильно высушенный (2,5 мл) – 2 фл., - плазма-калибратор, лиофильно высушенная (1,0 мл) - 1 фл., - хромогенный субстрат, лиофильно высушенный (2,0 мл) – 2 фл., - концентрат буфера (5,0 мл) – 2 фл.	40
ПФА-2/1	РеаКлот – АТIII тест. Исследование антитромбина III упрощенным клоттинговым методом. Состав: - тромбин лиофильно высушенный (1,0 мл) - 2 фл., - плазма-калибратор, дефибринированная, лиофильно высушенная (1,0 мл). – 1 фл., - концентрат буфера (5,0 мл) – 1 фл., - фибриноген, лиофильно высушенный (2,0 мл) – 4 фл.	80-160

 

Интерпретация результатов

У здоровых лиц активность антитромбина III варьирует от 80 до 125 %, при снижении активности до 40-60% наблюдаются спонтанные тромбозы и эмболии.

В большинстве случаев снижение плазменного уровня антитромбина III носит приобретенный характер из-за уменьшения биосинтеза, пассивной потери с биологическими жидкостями и в результате потребления на инактивацию сериновых протеаз при активации свертывающей системы крови. Уменьшение биосинтеза антитромбина III происходито при заболеваниях печени. Увеличение пассивной потери наблюдается при нефротических протеинуриях и энтеропатиях. При всех формах дефицита антитромбина III возникает ДВС-синдром.

СИСТЕМА ПРОТЕИНА С

Противосвертывающая система протеина С (протеин С, протеин S, тромбин, тромбомодулин, ингибитор протеина С) осуществляет важную функцию регуляции свертывающей активности плазмы крови. Действие системы направлено преимущественно на инактивацию ф. Vа и ф. VIIIа, что приводит к ингибированию фактора Ха и тромбина и к существенному удлинению времени свертывания. Ингибирование ф. Vа и ф. VIIIа зависит от комплексирования с протеином S.

Протеин С – это профермент витамин К зависимой протеиназы, ММ-62 000, активируется тромбином, реакция активации происходит на поверхности эндотелия, в ней принимает участие тромбомодулин. Концентрация протеина С в плазме крови составляет 4 мкг/мл, время полужизни – 8-10 ч, синтезируется в печени.

Протеин S, витамин К зависимый протеин плазмы, не является зимогеном и функционирует как кофактор, повышая степень инактивации факторов Va и VIIIa.. Концентрация протеина S в плазме составляет 20-25 мкг/мл, период полужизни – 42 ч. Врожденный дефицит протеина S характеризуется тромботическими проявлениями.

Тромбомодулин является трансмембранным протеином, локализуется на поверхности эндотелия, обеспечивает тромборезистентность сосудистой стенки и несет ангтикоагулянтную функцию, являясь высоко аффинным рецептором тромбина. Тромбин, связанный тромбомодулином, имеет сниженные прокоагулянтные свойства, но способен активировать систему протеина С и систему фибринолиза.

Активация системы протеина С является важнейшим защитным механизмом в ответ на тромбогенный стимул.

Гетерозиготный дефицит протеина С встречается сравнительно часто (1 на 200-300 чел.) и проявляется венозными тромбозами. Более 50% генетических форм тромбофилии у пациентов с тромбозами обусловлены дефектами в системе протеина С.

В организме активация системы протеина С осуществляется тромбином и фактором Ха, в условиях iv vitro этот процесс происходит медленно, и для его усиления в тест-систему вносят специфический активатор фактора Х, выделенный из яда змеи - щитомордника (Agkistrodon сontortrix сontortrix). В присутствии этого активатора, который также активирует факторы внутреннего пути свертывания, время свертывания в нормальной плазме увеличено, свыше 100 сек в тесте АЧТВ (при норме 30-40 сек). При смешивании исследуемой плазмы больного и плазмы, дефицитной по протеину С, увеличение времени свертывания будет пропорционально активности протеина С в плазме больного.

Нарушения в системе протеина С вызывают тромбозы различной локализации.

Гомозиготная недостаточность протеина С приводит к развитию фульминантной пурпуры у детей (несовместимой с жизнью). Гетерозиготный дефицит протеина С или протеина S проявляется ранними тромбозами: инфаркт миокарда, тромбоэмболя системы легочной артерии, тромбозы глубоких и поверхностных вен нижних конечностей, рецидивирующие тромбозы различной локализации и др. Кроме того, лечение тромбозов непрямыми антикоагулянтами (варфарином, пелентаном и др.) на фоне гетерозиготного дефицита протеина С может, с одной стороны, приводить к нарастанию клиники тромбозов, а с другой сопровождаться развитием острых некрозов кожных покровов различной локализации, так называемых “кумариновых некрозов”.

Охарактеризована новая форма наследственной тромбофилии, в основе которой лежит наличие у пациентов так называемого ф. V (Leiden). Суть этой формы заключается в том, что ф. V (Leiden) (мутантный ф. V) обладает резистентностью к действию активированного протеина С, что приводит к повышению свертывания крови по внутреннему и внешнему механизмам и повышает частоту тромбозов:тромбозы периферических вен, инфаркты миокарда, тромбоэмболии легочной артерии, тромбозы вен сетчатки глаза и др.

Приобретенный дефицит протеина С наблюдается при печеночной недостаточности, острых ДВС-синдромах, септических состояниях и утяжеляет течение основного заболевания и, в свою очередь, требует медикаментозной и трансфузионной коррекции.

Компания РЕНАМ выпускает 3 диагностических набора реагентов, предназначенных для определения общей активности системы протеина С, для определения активности протеина С фотометрическим методом с хромогенным субстратом, набор реагентов для выявления мутантного фактора V Лейден, резистентного к действию протеина С, а также 2 контрольные плазмы с нормальным и с пониженным уровнем протеина С.

 

Код	Наименование, состав набора, краткое описание	Число анализов
ПФА-3	Протеин С – тест для определения общей активности системы протеина С. Состав: - АЧТВ-реагент с активатором, лиофильно высушенный (2,0 мл) – 2 фл., - АЧТВ-реагент, лиофильно высушенный (2,0 мл)– 2 фл., - 0,025 М раствор СаСl2 (5,0 мл) – 1 фл., - плазма-калибратор, лиофильно высушенная (1,0 мл) – 1 фл.	40-80
ПФА-4	Реа PrС/FV-тест для определения резистентности активированного фактора V Лейден к действию протеина С. Состав: - АЧТВ-реагент с активатором, лиофильно высушенный (2,0 мл) – 1 фл., - АЧТВ-реагент, лиофильно высушенный (2,0 мл) – 1 фл., - раствор СаСl2 (5,0 мл) – 1 фл., - плазма-калибратор, лиофильно высушенная (1,0 мл) – 1 фл., плазма дефицитная по ф. V, лиофильно высушенная, (1,0 мл) – 4 фл.	10-20
ПФА-5	РеаХром Протеин С-тест для определения активности протеина С фотометрическим методом. Состав: - активатор протеина С, лиофильно высушенный (5,0 мл) – 2 фл., - плазма-калибратор, лиофильно высушенная (1,0 мл) – 1 фл., - хромогенный субстрат, лиофильно высушенный (2,0 мл) – 2 фл., - концентрат буфера (2,0 мл) – 1 фл.	20
ПФА-6	Плазма контрольная с нормальным уровнем активности системы протеина С (НО=0,7-1,1)	1 мл
ПФА-7	Плазма контрольная с пониженным уровнем активности системы протеина С (НО=0,3-0,6)	1 мл

 

Протеин С тест
Набор реагентов для определения общей активности системы протеина С

Набор Протеин С тест предназначен для ориентировочного выявления врожденной или приобретенной недостаточности противосвертывающей системы протеина С (протеин С, протеин S, тромбомодулин, тромбин, ингибитор протеина С), которая приводит к тромбозам различной локализации.

Набор предназначен для проведения 40 макроанализов или 80 микроанализов при расходе 0,1-0,05 мл каждого реагента на одно определение, соответственно.

 

Принцип метода.

Инкубация исследуемой плазмы с активатором (ядом щитомордника Agkistrodon сontortrix сontortrix) вызывает активацию эндогенного протеина С и протеина S, что удлиняет время свертывания нормальной плазмы в тесте АЧТВ. Без добавления активатора АЧТВ в этой же плазме не изменено.

В плазме с дефицитом активности системы протеина С или при наличии мутантного ф. V (Лейден) это удлинение менее выражено, чем в норме.

Порядок применения

При проведении исследования определяют 4 показателя:

1. АЧТВ контрольной плазмы без активатора;

2. АЧТВ контрольной плазмы с активатором;

3. АЧТВ плазмы пациента без активатора;

4. АЧТВ плазмы пациента с активатором.

Результаты анализа представляют в виде нормализованного отношения (НО, усл. ед.) по формуле:

       ,

 

где: АРТТ_а - АЧТВ плазмы с активатором, сек;

  АРТТ - АЧТВ плазмы без активатора, сек;

(АРТТ_а /АРТТ)_В – отношение активированного АЧТВ пациента к АЧТВ того же

пациента без активации, усл. ед.;

(АРТТ_а /АРТТ)_Н  - отношение активированного АЧТВ плазмы-калибратора к

АЧТВ плазмы-калибратора без активации, усл.ед.;.

Интерпретация результатов

У здоровых лиц НО составляет 0,7 - 1,3 усл. ед. Значение НО ниже 0,7 свидетельствует о значительных нарушениях в системе протеина С (функциональная неполноценность, сниженный синтез протеина С, протеина S) или о наличие мутантного фактора V (Лейден), резистентного к действию протеина С.

 

РеаХром-Протеин С тест
Набор реагентов для определения активности протеина С
фотометрическим методом

Набор РеаХром-Протеин С тест предназначен для определения активности протеина С в плазме крови человека высокочувствительным фотометрическим методом с хромогенным субстратом.

Набор предназначен для проведения 20 определений при расходе 0,05 мл раствора плазмы-калибратора на одно определение.

Принцип метода.

Метод определения активности протеина С в образце плазмы основан на способности активированного протеина С гидролизовать пептидный хромогенный субстрат. Количество высвобождаемого при этом пара-нитроанилина (р NА) прямо пропорционально активности протеина С в образце плазмы. Протеин С плазмы активируется при добавлении к ней очищенного экстракта яда Agkistrodon contortrix contortrix.

Процесс идет по следующей схеме:

Протеин С + активатор (избыток) Þ Активированный протеин С

Активир.Пр.С+ Пептид-рNА Þ Пептид + рNА (желтый)

 

Принцип метода

Инкубация нормальной плазмы с активатором протеина С (очищенным ферментом из яда щитомордника Agkistrodon сontortrix сontortrix) и с фактором контакта вызывает активацию эндогенного протеина С и коагуляционного каскада по внутреннему пути. Процесс свертывания запускается при добавлении ионов кальция. Активированный протеин С совместно с эндогенным протеином S инактивирует прокоагулянтные ф. VIIIa и ф. Va, что удлиняет время свертывания плазмы в тесте АЧТВ.

Время образования сгустка в плазме со сниженной активностью системы протеина С увеличивается в значительно меньшей степени. В плазме больных с дефицитом системы протеина С, а также у носителей мутантного ф. V (Leiden) удлинение АЧТВ при добавлении активатора выражено в меньшей степени, чем в норме.

При проведении исследования определяют 4 показателя:

АЧТВ смешанной контрольной плазмы без активатора;

АЧТВ смешанной контрольной плазмы с активатором;

АЧТВ смешанной плазмы больного без активатора;

АЧТВ смешанной плазмы больного с активатором.

Результаты результаты анализа представляют в виде нормализованного отношения (НО, усл. ед.) по формуле (см с.11)

Интерпретация результатов

У здоровых лиц НО составляет 1,1±0,3 усл. ед. Значение НО ниже 0,7 свидетельствует о возможном наличии мутантного ф. V (Leiden), резистентного к действию активированного протеина С.

 

ГЕПАРИН И ГЕПАРИНОТЕРАПИЯ

Гепарин, кислый мукополисахарид, вырабатываемый тучными клетками, является естественным противосвертывающим фактором. Относится к антикоагулянтам прямого действия, т. е. влияющим непосредственно на факторы свертывания (XII, ХI, Х, IX, VII и II). Гепарин применяют для профилактики и терапии различных тромбоэмболических заболеваний и их осложнений. Действие гепарина контролируют путем определения времени свертывания крови. После его введения наблюдаются значительное замедление рекальцификации плазмы, понижение толерантности к гепарину, удлинение тромбинового времени, резкое увеличение свободного гепарина (за счет введения антикоагулянта).

Несмотря на широкое применение стандартного (нефракционированного) гепарина в клинической практике, у этого препарата имеется ряд существенных недостатков. Во-первых, это высокая степень связывания гепарина с белками плазмы и его быстрая инактивация эндотелиальными клетками и макрофагами. Во-вторых, имеет место относительная кратковременность действия гепарина, вследствие чего требуется постоянная внутривенная инфузия в течение суток (или многократные подкожные инъекции препарата). Кроме того, гепарин не обладает последействием, и после окончания его применения условия для образования тромба восстанавливаются. Возможна активация тромботического процесса, что выражается в увеличении числа эпизодов ишемии миокарда и развитии инфаркта миокарда.

Наличие нежелательных свойств у стандартного (нефракционированного) гепарина потребовало создания антикоагулянтов нового поколения. Таковыми стали синтезированные из нефракционированного гепарина препараты, именуемые низкомолекулярными гепаринами.

Низкомолекулярные гепарины получают путем деполимеризации стандартного гепарина, при этом молекулярная масса фрагментов колеблется от 2 500 до 6 500 дальтон. Низкомолекулярные гепарины тормозят каскад свертывания крови на более высокой ступени - на уровне ф. Ха. Однако они тормозят и образование некоторого количества тромбина, что связывают с наличием в них полисахаридных фрагментов с молекулярной массой выше 5 400 дальтон. Именно в содержании последних лежит основное различие между низкомолекулярными гепаринами разного производства. Уменьшение размеров молекул отразилось на особенностях фармакокинетики и фармакодинамики низкомолекулярных гепаринов. Группу низкомолекулярных гепаринов характеризует большая продолжительность биологической активности, что позволяет назначать препараты 1- 2 раза в сутки. Низкомолекулярные гепарины в значительно меньшей степени, чем обычный гепарин, связываются с белками плазмы и клетками эндотелия. Этим объясняют их высокую биодоступность (после глубокой подкожной инъекции > 90%, у стандартного гепарина - 15-20%). Клиренс препаратов более медленный и более равномерный, чем обычного гепарина. Низкомолекулярные гепарины характеризует более предсказуемая антикоагулирующая реакция на введенную дозу и соответственно при их применении требуется меньший лабораторный контроль. Важным преимуществом низкомолекулярных гепаринов перед стандартным гепарином является значительно меньшее влияние на тромбоциты и низкая частота развития тромбоцитопении.

При проведении гепаринотерапии необходим лабораторный контроль содержания гепарина в плазме крови пациента.

 Компания РЕНАМ производит 2 диагностических набора реагентов для определения активности гепарина в плазме крови пациентов, а также набор плазм-калирбраторов для построения калибровочных графиков и набор контрольных плазм для проверки правильности исследований.

 

Код	Наименование, состав набора, краткое описание	Число анализов
ГП-1	РеаХром Гепарин для определения активности гепарина (анти-Ха активность) фотометрическим методом. Состав: - антитромбин III, лиофильно высушенный (1,0 мл) – 2 фл., - ф. X, лиофильно высушенный (2,0 мл) – 2 фл., - хромогенный субстрат, лиофильно высушенный (2,0 мл) – 2 фл., - концентрат буфера (5,0 мл) – 1 фл.	20
ГП-2	РеаКлот-Гепарин для определения активности гепарина (анти Ха активность) клоттинговым методом. Состав: - смесь ф. Ха с фосфолипидами, лиофильно высушенная (2,0 мл) -2 фл., - субстратная плазма, лиофильно высушенная (1,0 мл) - 2 фл., - раствор СаСl2 (5,0 мл)-1 фл.	80
ГП-3	Набор плазм-калибраторов для исследования гепарина. Состав: 3 уровня активности гепарина (0; 0,3-0,5; 0,7-1,0), лиофильно высушенные (1,0 мл)– 6 фл.	6 х 1 мл
ГП-4	Набор контрольных плазм для исследования гепарина. Состав: 2 уровня активности гепарина (0,3-0,5; 0,5-0,7), лиофильно высушенные (1,0 мл) – 6 фл.	6 х 1 мл

 

 

РеаХром Гепарин
Набор реагентов для определения анти-Xa активности гепарина
фотометрическим методом

Набор РеаХром Гепарин предназначен для определения активности гепарина в плазме крови человека с помощью метода нейтрализации ф. Ха. Активность гепарина в плазме крови исследуют при контроле антикоагулянтной терапии, которую проводят при инфаркте миокарда, легочной эмболии, остром тромбозе глубоких вен, гемодиализе, использовании аппарата сердце-легкие, при дооперационной и послеоперационной профилактике тромбоэмболии. Набор предназначен для проведения 20 макро- и 100 микроопределений при расходе 0,20-0,04 мл раствора хромогенного субстрата на одно определение.

Принцип метода.

Метод основан на способности комплекса антитромбин III-гепарин нейтрализовать активность ф. Ха. Активность гепарина определяют в плазме после добавления избытка антитромбина III (АТ III) и ф. Ха. При этом происходит ингибирование ф. Ха комплексом АТ III-гепарин прямо пропорционально активности гепарина в плазме. Остаточная активность ф. Ха катализирует отщепление пара-нитроанилина (pNa) от синтетического хромогенного субстрата.

Концентрация свободного pNa, определяемая при длине волны 405 нм, обратно пропорциональна активности гепарина в плазме.

Процесс идет по следующей схеме:

Антитромбин III (избыток) + гепарин Þ АТIII-гепарин

АТIII-гепарин + Ха (избыток) Þ АТIII-гепарин-Ха +Ха (остаток)

Пептид–pNa + Ха (остаток) ÞПептид-Ха + pNa (желтое окрашивание).

 

Принцип метода.

Метод основан на способности небольших количеств гепарина в исследуемой плазме в присутствии антитромбина III нейтрализовать экзогенный активированный ф. Ха.

В плазму вносят ф. Ха с фосфолипидами и субстратную плазму, содержащую антитромбин III, ф. V и фибриноген. Гепарин плазмы в присутствии антитромбина III инактивирует активность ф. Ха. Измеряют остаточную коагулологическую активность ф. Ха.

Интерпретация результатов.

Профилактическая область: 0,1-0,3 антиХа ед/мл.

Терапевтическая область: 0,3-0,7 антиХа ед/мл.

 

 

Плазма-калибратор (3 уровня активности гепарина)

Плазмы-калибраторы с тремя различными уровнями активности гепарина применяют при количественном определении анти-Xa активности низкомолекулярного гепарина в плазме крови пациентов для контроля гепаринотерапии. Плазмы-калибраторы используются для построения калибровочных графиков при определении анти-Ха активности гепарина при использовании наборов Реахром-Гепарин или Реаклот-Гепарин компании «РЕНАМ».

Плазма-калибратор, пулированная, собрана от 20 доноров в возрасте 20-40 лет, стабилизирована HEPES-цитратным буфером, содержит различное количество низкомолекулярного гепарина, лиофильно высушена (1,0 мл).

Флаконы силиконированы для предотвращения контактной активации.

 

Плазма контрольная (2 уровня активности гепарина)

Проверку правильности построения калибровочных прямых необходимо осуществлять с помощью контрольных плазм, выпускаемых компанией «РЕНАМ». Плазма контрольная анализируется одновременно с исследуемой плазмой больного при выполнении соответствующего теста. Исследуемый контрольный материал должен укладываться в диапазон значений, указанных в паспорте на данную серию плазмы контрольной.

Плазма контрольная, пулированная, собрана от 20 доноров в возрасте 20-40 лет, стабилизирована HEPES-цитратным буфером, содержит различное количество низкомолекулярного гепарина, лиофильно высушена (1,0 мл).

Флаконы силиконированы для предотвращения контактной активации.

Принцип метода.

Из плазмы крови выделяют эуглобулиновую фракцию, содержащую плазминоген, фибриноген и факторы свертывания и не содержащую ингибиторов фибринолиза. При добавлении к эуглобулиновой фракции плазмы активатора каолина происходит активация ф. XII, активация прекалликреина в калликреин и преобразование плазминогена в плазмин. При добавлении кальция хлористого образуется сгусток фибрина, который лизируется плазмином за 5-12 мин.

Плазминоген

Плазминоген – белок, широко распространенный в организме, максимальное его количество (0,2 мг/мл) находится в плазме крови в виде нескольких изоформ, различающихся составом и молекулярной массой (83000-93000 D). Концентрация плазминогена в крови может снижаться при заболеваниях почек, циррозе печени, фибринолитических кровотечениях и повышаться при злокачественных заболеваниях, туберкулезе и облучении рентгеновскими лучами. Молекула плазминогена представляет собой одну полипептидную цепь. При активации в плазмин от молекулы плазминогена отщепляется два пептида и образуется молекула плазмина с молекулярной массой 76500-85000 D, состоящая из двух полипептидных цепей.

Плазминоген может активироваться до плазмина различными путями, наиболее важным из которых является активация природным тканевым активатором, который синтезируется и высвобождается эндотелиальными клетками. Активировать плазминоген могут также такие внешние активаторы, как стрептокиназа из гемолитического стрептококка и урокиназа, природный активатор из почек.

Плазмин, активный фермент, принимающий участие как в первичном, так и во вторичном фибринолизе.

Антиплазминовым действием обладают антитромбин III, α₁ –антитрипсин, α₂ –антиплазмин, α₂ – макроглобулин и др. Ингибиторы находятся в крови в избытке и способны образовывать обратимые комплексы с плазмином.

Потребление плазминогена наблюдается как при первичном, так и при вторичном фибринолизе. Вторичный фибринолиз, связанный с ДВС, является наиболее важной причиной потребления плазминогена. С другой стороны первичный фибринолиз, включающий только фибринолитический механизм, также вызывает быстрое потребление циркулирующего фермента.

Исследование плазминогена проводится при лечении больных с ДВС-синдромом, при диагностике тромбофилий, для контроля за лечением тромболитиками (при тромбозах, тромбоэмболиях, инфарктах).

РеаХром-Плазминоген
Набор реагентов для определения активности плазминогена
 фотометрическим методом

Принцип метода.

Метод определения активности плазминогена в образце плазмы крови основан на его способности образовывать комплекс со стрептокиназой, который гидролизует пептидный хромогенный субстрат. Количество высвобождающегося при этом паранитроанилина (рНА) прямо пропорционально активности плазминогена в образце плазмы.

Процесс идет по следующей схеме:

Плазминоген + стрептокиназа (избыток)= комплекс

Комплекс + пептид-рНА=пептид + рНА (желтый)

Принцип метода.

П