Методы оценки системы комплемента

Комплемент - это группа сывороточных белков, состоящая из протеаз и их активаторов. Существуют два механизма активации комплемента - классический и альтернативный. Комплемент играет важную роль в защите от микробов, активирует катаболизм циркулирующих иммунных комплексов и участвует в регуляции функций иммунной системы.

Для исследования компонентов классического пути активации комплемента определяют его гемолитическую активность. Суть метода заключается в следующем: 1) разные разведения сыворотки больного и нормальной сыворотки добавляют к эритроцитам барана, покрытым антителами; 2) степень гемолиза оценивают фотометрически по выходу гемоглобина в раствор. За единицу гемолитической активности комплемента принимают величину, обратную тому разведению сыворотки, при котором разрушаются 50% эритроцитов. Определение гемолитической активности комплемента позволяет обнаружить недостаточность компонентов комплемента, прежде всего участвующих в образовании мембраноатакующего комплекса. Кроме того, оценка этого показателя может использоваться для выявления активации комплемента, например при системной красной волчанке и гломерулонефрите, хотя чувствительность метода для этого недостаточно высока. Альтернативный путь активации комплемента исследуют редко.

Определение компонентов комплемента обычно проводят при обследовании больных с аутоиммунными заболеваниями и при подозрении на генетический дефект комплемента. Количественное определение компонентов комплемента проводят с помощью простой радиальной иммунодиффузии и нефелометрии. Так, у 15% больных с наследственным ангионевротическим отеком количественные методы исследования выявляют нормальный уровень ингибитора C1-эстеразы, в то время как его активность снижена. Функциональную активность отдельных компонентов комплемента в сыворотке исследуют следующим образом: 1) к стандартной сыворотке, лишенной какого-либо компонента комплемента, добавляют исследуемую сыворотку (источник недостающего компонента комплемента); 2) определяют гемолитическую активность комплемента. Если гемолитическая активность комплемента не восстанавливается до нормы, значит, активность этого компонента комплемента в исследуемой сыворотке снижена. Иногда дополнительно оценивают активность регуляторных компонентов комплемента, например ингибитора C1-эстеразы.

 

Иммунологические методы, основанные на реакции антиген-антитело

Такие реакции часто называют «серологическими», так как длительное время единственным источником антител служила сыворотка. С помощью этих методов решаются две основные задачи: выявление антител и антигенов. Определение антител проводят в реакциях с известными антигенами, для обнаружения антигенов используют антитела.

К группе методов, основанных на использовании меченых антител, относятся иммунофлюоресцентный, радиоиммунный и иммуноферментный анализ. Клиническое значение этих методов заключается в том, что они позволяют выявлять специфические антитела, а также различные молекулы, играющие важную роль в патологии человека, и не определяемые в стандартных биохимических методах (концентрация гормонов, витаминов, онкофетальных антигенов и др.).

 

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Суть метода заключена в соединении компонентов реакции антиген-антитело с измеряемой ферментной меткой. Антигены или антитела, вступающие в реакцию, метятся ферментом. По превращению субтрата ферментом можно судить о количестве вступившего во взаимодействие компонента реакции антиген-антитело. Различают гомогенный и гетерогенный (твердофазный) ИФА.

Твердофазный ИФА. В качестве твердой фазы чаще всего используются полистироловые планшеты с сорбированными на них антигенами или антителами. Определение антител к какому-либо антигену проводят следующим образом: 1) исследуемую жидкость вносят в лунки планшета с сорбированным на них антигеном; 2) во время инкубации антитела связываются с антигеном; 3) планшет отмывают от несвязавшихся антител и добавляют антитела к иммуноглобулинам (вторые антитела), меченные ферментом; 4) планшет вновь отмывают, добавляют субстрат фермента и хромоген (вещество, меняющее окраску в процессе химической реакции); 5) под действием продукта ферментативной реакции хромоген меняет окраску. Чем больше меченных ферментом вторых антител связывается с комплексами антиген-антитело, тем выше активность фермента и интенсивность окраски раствора. Концентрацию антител в пробе определяют спектрофотометрически - по оптической плотности окрашенного раствора. Такой же подход применяется для определения антигена в пробе. В этом случае используются планшеты с сорбированными антителами к исследуемому антигену, меченные ферментом вторые антитела также направлены к этому антигену. Твердофазный ИФА применяют для количественной оценки антител и антигенов. Многие лаборатории используют твердофазный ИФА в качестве стандартного метода определения противовирусных антител, включая антитела к ВИЧ, цитокинов и иммуноглобулинов (IgE и подклассов IgG).

К основным достоинствам метода ИФА относится его высокая чувствительность, что дает возможность определения иммуноглобулинов в разнообразных биологических жидкостях, быстрое проведение анализа, возможность автоматизации процесса, а также простота и дешевизна. По чувствительности ИФА сопоставим с РИА, но не требует применения радиоактивных изотопов.

 

Радиоиммунный анализ (РИА)

Этот высокочувствительный метод разработан в 1960 г., он является предшественником иммуноферментного анализа. Принципы этих методов аналогичны, но в радиоиммунном анализе используется радиоактивная метка. Для определения иммуноглобулинов используется мало, и сначала использовался для определения концентрации инсулина и других гормонов. Сейчас он используется и для определения антигенов и антител. Существует несколько модификаций метода. Одна из них основана на конкурентном связывании меченного радиоактивным изотопом и немеченого антигена с антителами. Суть метода заключается в следующем: 1) известное количество антител смешивают с известным количеством меченого антигена и исследуемой пробой (содержащей неизвестное количество антигена); 2) антиген, содержащийся в пробе, и стандартный меченый антиген связываются с антителами, 3) чем выше содержание немеченого антигена, тем меньше меченого антигена свяжется с антителами. Концентрацию антигена в исследуемой пробе оценивают по уровню радиоактивности иммунных комплексов. Тот же подход может быть использован для определения концентрации антител в пробе. В этом случае известное количество антигена смешивают с известным количеством стандартных меченых антител и исследуемой пробой (содержащей неизвестное количество антител). Другая модификация метода основана на иммобилизации антигена или антитела на твердой подложке. Основные недостатки метода - необходимость дорогостоящего оборудования и реактивов, а также условий для работы с радиоактивными изотопами.

 

Иммунофлюоресцентный анализ

Антиген иммобилизуется на подложке, к нему добавляются антитела 1-го порядка, связывающиеся непосредственно с антигеном. В исследуемый образец добавляются антитела 2-го порядка, связывающиеся с антигенными детерминантами антител 1-го порядка. Антитела 2-го порядка имеют флюоресцирующую метку. Поскольку участков связывания может быть несколько, то реакция проявляется более отчетливо.

Для обнаружения тканевых или микробных антигенов можно использовать антитела, коньюгированные с флюорохромами. Их свечение возбуждается ультрафиолетом и исследуется при помощи люминисцентного микроскопа. В качестве метки чаще всего применяют флюоресцеин.

Метод используется в двух основных вариантах: прямом и непрямом. В первом случае антитела, коньюгированные с флюорохромом, вступают в непосредственный контакт с антигенами, фиксированным на предметном стекле (мазки из инфицированного материала, тканевые срезы). В зонах локализации антигена возникает свечение. Непрямая иммунофлюоресценция - метод, с помощью которого можно выявить антитела к известным антигенам. В качестве источника антигена обычно используют срезы тканей или культуры клеток. Субстрат, перенесенный на предметное стекло, инкубируют в присутствии исследуемой пробы, например сыворотки, а затем - в присутствии меченных флюорохромом антител к иммуноглобулинам. Связанные с субстратом антитела выявляют с помощью флюоресцентного микроскопа. Этот метод обычно применяется для выявления антинуклеарных антител и антител к некоторым вирусам. Хотя метод не является количественным, он достаточно чувствителен и прост.

Иммуноблоттинг - качественный метод, позволяющий выявлять антигены и антитела в исследуемой пробе. Антитела с помощью этого метода выявляют следующим образом: 1) смесь известных антигенов разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и переносят на нитроцеллюлозную мембрану; 2) мембрану инкубируют с исследуемой пробой, например сывороткой, а затем - с мечеными антителами к иммуноглобулинам. Для выявления антигенов электрофоретическому разделению подвергаются белки исследуемой пробы, которые затем переносятся на мембрану с последующим добавлением меченых антител к известным антигенам. В настоящее время выпускаются готовые наборы для проведения иммуноблоттинга. Этот метод широко применяется для подтверждения результатов твердофазного ИФА при диагностике ВИЧ-инфекции.

Иммунологическое обследование проводится в специализированных, оборудованных соответствующим образом лабораториях.

Иммунологическое обследование в лаборатории клинической иммунологии выполняется в следующем объеме:

Иммунокомпетентные клетки.

1. Лимфоцитоз.

2. Относительное содержание CD3⁺ , CD4⁺, CD8⁺, CD19⁺, CD20⁺, CD16⁺ клеток, HLA-DR⁺ моноцитов.

3. Относительное содержание CD4⁺, CD8⁺ клеток, экспрессирующих HLA-DR.

4. Фагоцитоз (моноциты, гранулоциты).

5. Продукция перекиси водорода (моноциты, нейтрофилы).

6. Активность эффекторов ГЗТ.

Иммуноглобулины и антитела.

1. Иммуноглобулины A, M, G

2. Иммуноглобулин класса E

3. Циркулирующие иммунные комплексы

4. Антитела (к тиреоглобулину, микросомальной фракции тиреоцитов, кардиолипину, ДНК; ревматоидный фактор).