Неспецифические факторы защиты

Содержание

 

Предисловие

Введение

1. Области использования иммунодиагностики

2. Иммунологические методы в диагностике заболеваний иммунной системы

2.1 Количественное определение популяций лимфоцитов

2.1.1 Проточная цитометрия

2.1.2 CD-классификация мембранных молекул иммунокомпетентных клеток

2.1.2 Маркеры активации лимфоцитов

2.2 Методы оценки функциональной активности лимфоцитов

2.2.1 Определение пролиферативной способности лимфоцитов

2.2.2 Определение цитотоксической активности Т-лимфоцитов

2.2.3 Оценка ГЗТ in vivo

2.2.4 Оценка цитотоксической активности естественных киллеров

2.2.5 Методы количественного определения иммуноглобулинов

2.3 Методы исследования функций фагоцитов

2.3.1 Методы определения хемотаксиса лейкоцитов

2.3.2 Определение адгезивных свойств

2.3.3 Определение фагоцитарной способности

2.3.4 Оценка бактерицидной активности

2.4 Методы оценки системы комплемента

3. Иммунологические методы, основанные на реакции антиген-антитело

3.1 Иммуноферментный анализ

3.2 Радиоиммунный анализ

3.3 Иммунофлюоресцентный анализ

4. Методы исследования цитокинов

Заключение

Вопросы для самоконтроля

Задания в тестовой форме

Словарь иммунологических терминов

Библиографический список

 

Предисловие

 

Согласно определению ВОЗ клиническая иммунология - это клиническая и лабораторная дисциплина, занимающаяся изучением вопросов диагностики и лечения больных с различными заболеваниями и патологическими состояниями, в основе которых лежат иммунологические механизмы, а также состояниями, в терапии и профилактике которых иммуноактивные препараты играют ведущую роль. Обращает на себя внимание то, что иммунология - это и лабораторная дисциплина. Сложилось так, что иммунологические методы используются очень широко в различных областях медицины. Главным образом, это методы, основанные на иммунных реакциях (антиген+антитело, ГЗТ). Одной из задач клинической иммунологии в современной медицине является обогащение ее иммунологическими подходами к диагностике и лечению заболеваний.

Данное пособие адресовано студентам лечебного и педиатрического факультетов, изучающим клиническую иммунологию, в частности, при подготовке по разделу 2 «Оценка иммунного статуса. Иммунодиагностика», темы 2 «Методы оценки иммунного статуса и их клиническая интерпретация» учебно-методического плана. Пособие содержит развернутый систематизированный материал по данной теме, освещающий возможности современной иммунодиагностики, области использования иммунологических методов в различных областях клинической медицины, методологию иммунодиагностики основных заболеваний иммунной системы, основные иммунологические методы.

Настоящее учебное пособие будет способствовать формированию представлений о принципах иммунодиагностики; приобретению знаний о показаниях для исследования иммунного статуса, количественных и функциональных тестах оценки Т-клеточного, В-клеточного иммунитета, НК-клеток, фагоцитоза, комплемента и их клинического значение, умений определять показания для исследования иммунного статуса, интерпретировать основные показатели иммунного статуса.

Изучение данного вопроса предполагает преемственность и базируется на знаниях, приобретенных студентами на младших курсах при изучении смежных дисциплин (микробиология, общая биология, и др.). В то же время, полученные студентами знания могут быть востребованы при изучении целого ряда других клинических дисциплин образовательной программы (гематология, трансплантология, онкология, инфекционные болезни и др.).

Настоящее пособие посвящено 2 и 3 разделам рабочей программы по дисциплине “клиническая иммунология”.

 

Введение

 

Впервые методология иммунодиагностики заболеваний иммунной системы была разработана в нашей стране Р.В. Петровым и соавторами, опубликовавшими в 1984 г. методические рекомендации «Оценка иммунного статуса человека». В соответствии с этими методическими рекомендациями все методы иммунодиагностики разделены на тесты I и II уровней. Тесты I уровня направлены на идентификацию грубых поломок иммунной системы, т.е. первичных иммунодефицитов; тесты II уровня - на углубленное изучение функционального состояния иммунной системы.

К тестам I уровня относят:

определение функциональной активности фагоцитов;

определение численности основных популяций и субпопуляций лимфоцитов;

определение концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови.

К тестам II уровня относятся:

определение субпопуляций регуляторных Т-лимфоцитов;

тест торможения миграции лейкоцитов с использованием в качестве стимулятора ФГА (фитогемагглютинина);

- оценка пролиферативной активности Т- и В- лимфоцитов на митогены, антигены, аллогенные клетки;

оценка активности киллерных лимфоцитов;

выявление циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК);

- определение различных компонентов комплемента;

- оценка различных этапов фагоцитоза и рецепторного аппарата фагоцитов;

- тесты по определению медиаторов иммунной системы, в том числе продукции и рецепции интерлейкинов;

- анализ генов, ответственных за экспрессию иммунологически значимых молекул.

В пособии приведены современные принципы оценки состояния основных звеньев иммунной системы человека для диагностики нарушений иммунной системы при иммунопатологических состояниях. Представлен краткий обзор современных лабораторных методов, используемых в иммунологии. Также охарактеризованы возможности использования иммунологических методов в различных областях клинической медицины.

лимфоцит антиген иммунодиагностика

 

1. Области использования иммунодиагностики

 

Представляем данные об использовании иммунологических методов в разных областях медицины. Современная диагностика любого инфекционного заболевания основывается на обнаружении возбудителя болезни (бактериологические методы, ПЦР) или на выявлении специфического иммунного ответа на возбудителя (антитела, ГЗТ). Так, в диагностике ВИЧ-инфекции выявление антител с помощью ИФА является скрининговым методом, а подтверждающим - иммуноблотинг, позволяющий идентифицировать антитела к различным антигенам вируса. Все вирусные, многие бактериальные инфекции диагностируют путем выявления специфических антител (IgM и IgG) к поверхностным антигенам микроорганизмов. ГЗТ чаще оценивают in vivо, например, в диагностике туберкулеза.

Эндокринология, гематология и другие области внутренней медицины широко используют иммунологические методы в диагностике.

Верификация опухолевого клона в диагностике онкологических и онкогематологических заболеваний проводится морфологическими методами («золотой» стандарт) и путем фенотипирования опухолевых клеток. Иммунофенотипирование клеток - это определение поверхностных маркёров и, соответственно, принадлежности клеток к той или иной субпопуляции. Традиционные морфологические и цитохимические исследования клеток субстрата болезни (кровь, красный костный мозг, лимфатические узлы, селезёнка и т.д.) во многих случаях, особенно при лимфопролиферативных заболеваниях, не позволяют выявить всё многообразие вариантов среди морфологически сходных форм и установить источник происхождения патологического клона. Эти задачи могут быть решены только путём изучения иммунологической характеристики клеток. При неопластических изменениях блок дифференцировки может произойти на любой стадии нормального развития клеток, в результате чего образуется клон патологических клеток, определяющих субстрат болезни и имеющих одинаковую иммунологическую (или фенотипическую) характеристику. Проведя исследования этих маркёров на клетках, можно определить, какой форме и варианту заболевания они соответствуют, то есть на основе иммунологического фенотипа клеток проводить дифференциальную диагностику, которая наиболее трудна при лимфопролиферативных заболеваниях, потому что основной клеткой патологического субстрата болезни являются морфологически почти однотипные клетки. В диагностике минимальной резидуальной болезни (МРБ) могут использоваться иммунологические методы, в частности, иммунофенотипирование методом проточной цитометрии. Минимальной резидуальной или минимальной остаточной болезнью называют небольшую популяцию опухолевых клеток, которая не может быть зафиксирована с помощью морфологических методов, но обнаруживается более тонкими методами исследования, выявляющими 0,03%- 0,5% клеток аберрантного фенотипа.

Определение концентрации различных биологически-активных веществ: гормонов, онкофетальных антигенов, витаминов и других молекул, не определяемых стандартными биохимическими методами, может осуществляться только на основе иммунологических методов (главным образом, ИФА).

 

2. Иммунологические методы в диагностике заболеваний иммунной системы

 

Для объективной оценки состояния иммунной системы человека введено понятие об иммунном статусе. Иммунный статус - это комплекс показателей, характеризующих субпопуляционный состав лимфоцитов, гуморальный и клеточный иммунитет, фагоцитарное звено, то есть практически всю иммунную систему человека в данный момент времени. Исследование иммунного статуса проводится с целью уточнения диагноза, определения тактики лечения и прогноза при первичных иммунодефицитах, ВИЧ-инфекции и других вторичных иммунодефицитах, аутоиммунных, аллергических заболеваниях.

Иммунодиагностика предполагает идентификацию нарушенного звена иммунной системы, индивидуальна для данного заболевания у конкретного больного. Наибольшее значение иммунодиагностика имеет при иммунодефицитах. При аутоиммунных заболеваниях иммунологические методы применяются для подтверждения клинического диагноза: например определение аутоантител. При аллергических заболеваниях иммунодиагностика позволяет выявить причинный аллерген и определяет возможности аллерген-специфической иммунотерапии. Дальнейшее изучение дисциплины, а именно частных вопросов иммунопатологии, предполагает анализ результатов исследования иммунного статуса для постановки диагноза и показаний к терапии.

Для оценки иммунной системы человека рекомендованы следующие основные методы (ВОЗ, 1993):

Т-лимфоциты

определение субпопуляций

оценка пролиферации in vitro на митогены

оценка цитотоксичности

оценка эффекторов ГЗТ

кожные тесты с микробными АГ in vivo

В-лимфоциты

определение количества В-клеток

иммуноглобулины, субклассы

иммунные комплексы

оценка пролиферации in vitro

оценка продукции АТ разной специфичности

Моноциты/макрофаги

фагоцитоз

хемотаксис

адгезия

Цитокины

определение концентрации цитокинов в сыворотке

определение растворимых рецепторов цитокинов

определение внутриклеточных цитокинов.

Далее приведены основные иммунологические методы, используемые для оценки иммунной системы человека.

Основными объектами для иммунологического обследования являются иммунокомпетентные клетки (Т-, В, NK-лимфоциты, моноциты),получаемые из периферической крови, а также регуляторные и эффекторные молекулы (цитокины, комплемент и др.) из сыворотки (плазмы) крови. В некоторых случаях исследуются иммунокомпетентные клетки и регуляторные молекулы из тканей и различных биологических жидкостей.

Проточная цитометрия

Определение содержания основных популяций лимфоцитов (морфологически представляющие собой единообразные клетки) основано на выявлении поверхностных антигенов (дифференцировочных антигенов).

В настоящее время для определения поверхностных антигенов лимфоцитов (иммунофенотипирование) применяются моноклональные антитела, меченные флюорохромом, и проточный цитофлюориметр.

Метод получения моноклональных антител (МАТ), который предложили в 1975 г. Георг Келер и Цезарь Мильштейн, быстро стал одной из ключевых иммунологических технологий. Путем слияния нормальных активированных антителопродуцирующих В-лимфоцитов и миеломных клеток (плазматических опухолевых клеток) образована гибридная клетка, названная гибридомой, которая обладает способностью неограниченного роста миеломной клетки и секретирует антитела как В-клетка. Значение работы Келера и Мильштейна было признано Нобелевской премией (1984 г.)

Логика получения моноклональных анител проста: необходимо изолировать единственную антителопродуцирующую клетку, обеспечив ее длительное размножение и функционирование. Проблему решает гибридома - соматический гибрид между В-лимфоцитами и опухолевыми клетками. Получение гибридом сводится к следующему. Мышей иммунизируют антигеном. Через несколько дней, когда в лимфоидной ткани накапливаются активированные лимфоциты, из селезенки готовят взвесь клеток, которые используют для гибридизации. Спленоциты смешивают с миеломными клетками в присутствии агента, способствующего слиянию клеточных мембран. Отбирают «успешные» клеточные гибриды, которые секретируют антитела требуемой специфичности. Размножаясь, они дают начало «бессмертным» клонам, продуцирующим моноколональные антитела.

Моноклональные антитела используются не только для выявления разных типов клеток, но и для изучения процессов дифференцировки, созревания, межклеточного взаимодействия и активации лимфоцитов. Проточный цитофлюориметр - прибор, позволяющий быстро оценить состав клеточной популяции по флюоресценции и оптическим характеристикам клеток. С помощью этого прибора можно определить абсолютное и относительное число клеток разных популяций и субпопуляций. К основным преимуществам метода относятся быстрота анализа и возможность одновременной оценки многих параметров клетки: размера, оптической плотности, поверхностных антигенов. Результаты исследования выражают в виде абсолютного и относительного числа лимфоцитов разных популяций. Оценку результатов проводят с учетом нормальных показателей, которые зависят от возраста, пола и расы. Простой способ проверки надежности результатов заключается в том, что относительное содержание основных популяций лимфоцитов (Т, В и НК-лимфоцитов) в сумме должно составлять 100%. В норме у взрослых около 70% лимфоцитов крови составляют Т-лимфоциты, при этом соотношение лимфоцитов CD4/CD8 превышает 1, как правило, оно составляет 1,5-2,0 остальные 30% приходятся на В- и НК-лимфоциты.

Метод применяется для определения субпопуляций лимфоцитов (например, содержание лимфоцитов CD 4 при ВИЧ-инфекции), оценки функциональной состоятельности иммунокомпетентных клеток (фагоцитарная активность, определение внутриклеточных цитокинов). Этот метод применяется также для выявления других изменений клеточного состава крови и определения активированных лимфоцитов, определения антигенов гистосовместимости. Проточная цитофлюориметрия применяется также для анализа ДНК при исследовании клеточного цикла. Проточная цитофлюориметрия является стандартным методом диагностики гемобластозов, поскольку позволяет определить тип и стадию дифференцировки трансформированных клеток. В онкологии метод находит применение, в частности, для определения специфических маркеров.

 

Оценка ГЗТ in vivo

Кожные пробы позволяют оценить способность Т-лимфоцитов вызывать реакцию замедленного типа при внутрикожном введении антигена. Размеры эритемы и папулы в месте инъекции определяют через 24 и 48 ч. Поскольку отрицательная реакция может быть следствием не только нарушения иммунитета, но и отсутствия предшествующего контакта с данным антигеном, пробу проводят с набором широко распространенных антигенов, в который входят очищенный туберкулин <http://clinlab.ru/txt/htmbooks/drugs/dr1257.htm>, столбнячный <http://clinlab.ru/txt/htmbooks/drugs/dr1114.htm> и дифтерийный анатоксины <http://clinlab.ru/txt/htmbooks/drugs/dr1134.htm>. Отрицательная реакция на несколько распространенных антигенов у больных с оппортунистическими инфекциями свидетельствует о выраженной недостаточности клеточного иммунитета.

Снижение функциональной активности Т-лимфоцитов приводит к клиническим проявлениям инфекций, вызываемых внутриклеточными бактериями, вирусами, грибами, простейшими (пневмония, вызываемая Pneumocystic carinii, цитомегаловирусная инфекция, токсоплазмоз, криптоспоридиоз и др.); опухолевому росту.

Активация клеточных эффекторных функций может лежать в основе воспаления при аллергии (контактный дерматит) и аутоиммуных заболеваниях (ревматоидный артрит, рассеянный склероз, псориаз).

 

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Суть метода заключена в соединении компонентов реакции антиген-антитело с измеряемой ферментной меткой. Антигены или антитела, вступающие в реакцию, метятся ферментом. По превращению субтрата ферментом можно судить о количестве вступившего во взаимодействие компонента реакции антиген-антитело. Различают гомогенный и гетерогенный (твердофазный) ИФА.

Твердофазный ИФА. В качестве твердой фазы чаще всего используются полистироловые планшеты с сорбированными на них антигенами или антителами. Определение антител к какому-либо антигену проводят следующим образом: 1) исследуемую жидкость вносят в лунки планшета с сорбированным на них антигеном; 2) во время инкубации антитела связываются с антигеном; 3) планшет отмывают от несвязавшихся антител и добавляют антитела к иммуноглобулинам (вторые антитела), меченные ферментом; 4) планшет вновь отмывают, добавляют субстрат фермента и хромоген (вещество, меняющее окраску в процессе химической реакции); 5) под действием продукта ферментативной реакции хромоген меняет окраску. Чем больше меченных ферментом вторых антител связывается с комплексами антиген-антитело, тем выше активность фермента и интенсивность окраски раствора. Концентрацию антител в пробе определяют спектрофотометрически - по оптической плотности окрашенного раствора. Такой же подход применяется для определения антигена в пробе. В этом случае используются планшеты с сорбированными антителами к исследуемому антигену, меченные ферментом вторые антитела также направлены к этому антигену. Твердофазный ИФА применяют для количественной оценки антител и антигенов. Многие лаборатории используют твердофазный ИФА в качестве стандартного метода определения противовирусных антител, включая антитела к ВИЧ, цитокинов и иммуноглобулинов (IgE и подклассов IgG).

К основным достоинствам метода ИФА относится его высокая чувствительность, что дает возможность определения иммуноглобулинов в разнообразных биологических жидкостях, быстрое проведение анализа, возможность автоматизации процесса, а также простота и дешевизна. По чувствительности ИФА сопоставим с РИА, но не требует применения радиоактивных изотопов.

 

Радиоиммунный анализ (РИА)

Этот высокочувствительный метод разработан в 1960 г., он является предшественником иммуноферментного анализа. Принципы этих методов аналогичны, но в радиоиммунном анализе используется радиоактивная метка. Для определения иммуноглобулинов используется мало, и сначала использовался для определения концентрации инсулина и других гормонов. Сейчас он используется и для определения антигенов и антител. Существует несколько модификаций метода. Одна из них основана на конкурентном связывании меченного радиоактивным изотопом и немеченого антигена с антителами. Суть метода заключается в следующем: 1) известное количество антител смешивают с известным количеством меченого антигена и исследуемой пробой (содержащей неизвестное количество антигена); 2) антиген, содержащийся в пробе, и стандартный меченый антиген связываются с антителами, 3) чем выше содержание немеченого антигена, тем меньше меченого антигена свяжется с антителами. Концентрацию антигена в исследуемой пробе оценивают по уровню радиоактивности иммунных комплексов. Тот же подход может быть использован для определения концентрации антител в пробе. В этом случае известное количество антигена смешивают с известным количеством стандартных меченых антител и исследуемой пробой (содержащей неизвестное количество антител). Другая модификация метода основана на иммобилизации антигена или антитела на твердой подложке. Основные недостатки метода - необходимость дорогостоящего оборудования и реактивов, а также условий для работы с радиоактивными изотопами.

 

Иммунофлюоресцентный анализ

Антиген иммобилизуется на подложке, к нему добавляются антитела 1-го порядка, связывающиеся непосредственно с антигеном. В исследуемый образец добавляются антитела 2-го порядка, связывающиеся с антигенными детерминантами антител 1-го порядка. Антитела 2-го порядка имеют флюоресцирующую метку. Поскольку участков связывания может быть несколько, то реакция проявляется более отчетливо.

Для обнаружения тканевых или микробных антигенов можно использовать антитела, коньюгированные с флюорохромами. Их свечение возбуждается ультрафиолетом и исследуется при помощи люминисцентного микроскопа. В качестве метки чаще всего применяют флюоресцеин.

Метод используется в двух основных вариантах: прямом и непрямом. В первом случае антитела, коньюгированные с флюорохромом, вступают в непосредственный контакт с антигенами, фиксированным на предметном стекле (мазки из инфицированного материала, тканевые срезы). В зонах локализации антигена возникает свечение. Непрямая иммунофлюоресценция - метод, с помощью которого можно выявить антитела к известным антигенам. В качестве источника антигена обычно используют срезы тканей или культуры клеток. Субстрат, перенесенный на предметное стекло, инкубируют в присутствии исследуемой пробы, например сыворотки, а затем - в присутствии меченных флюорохромом антител к иммуноглобулинам. Связанные с субстратом антитела выявляют с помощью флюоресцентного микроскопа. Этот метод обычно применяется для выявления антинуклеарных антител и антител к некоторым вирусам. Хотя метод не является количественным, он достаточно чувствителен и прост.

Иммуноблоттинг - качественный метод, позволяющий выявлять антигены и антитела в исследуемой пробе. Антитела с помощью этого метода выявляют следующим образом: 1) смесь известных антигенов разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и переносят на нитроцеллюлозную мембрану; 2) мембрану инкубируют с исследуемой пробой, например сывороткой, а затем - с мечеными антителами к иммуноглобулинам. Для выявления антигенов электрофоретическому разделению подвергаются белки исследуемой пробы, которые затем переносятся на мембрану с последующим добавлением меченых антител к известным антигенам. В настоящее время выпускаются готовые наборы для проведения иммуноблоттинга. Этот метод широко применяется для подтверждения результатов твердофазного ИФА при диагностике ВИЧ-инфекции.

Иммунологическое обследование проводится в специализированных, оборудованных соответствующим образом лабораториях.

Иммунологическое обследование в лаборатории клинической иммунологии выполняется в следующем объеме:

Иммунокомпетентные клетки.

1. Лимфоцитоз.

2. Относительное содержание CD3⁺ , CD4⁺, CD8⁺, CD19⁺, CD20⁺, CD16⁺ клеток, HLA-DR⁺ моноцитов.

3. Относительное содержание CD4⁺, CD8⁺ клеток, экспрессирующих HLA-DR.

4. Фагоцитоз (моноциты, гранулоциты).

5. Продукция перекиси водорода (моноциты, нейтрофилы).

6. Активность эффекторов ГЗТ.

Иммуноглобулины и антитела.

1. Иммуноглобулины A, M, G

2. Иммуноглобулин класса E

3. Циркулирующие иммунные комплексы

4. Антитела (к тиреоглобулину, микросомальной фракции тиреоцитов, кардиолипину, ДНК; ревматоидный фактор).

Вопросы для самоконтроля

 

1. Назовите иммунологический метод, используемый для количественного определения популяций и субпопуляций лимфоцитов.

2. Что понимают под иммунным статусом?

3. Перечислите основные дифференцировочные антигены (маркеры) зрелых Т-лимфоцитов, хелперных Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, НК-клеток.

4. Назовите метод, используемый для оценки функциональной активности Т- и В-лимфоцитов.

5. Какие методы используются для количественного определения иммуноглобулинов сыворотки крови (IgG, IgM, IgA)?

6. Назовите иммунологический метод, наиболее часто используемый для определения специфических антител.

7. Какие функции моноцитов и макрофагов можно оценить с помощью лабораторных методов?

8. Какие методы используются для оценки бактерицидности фагоцитов?

9. Что такое НСТ-тест?

10. Функцию каких клеток позволяет оценить метод ГЗТ in vivo?

11. Назовите иммунологические методы, основанные на реакции антиген-антитело.

 

Библиографический список

 

1. Аллергология и иммунология: национальное руководство / Под ред. Хаитова Р.М., Ильиной Н.И. - М.: ГОЭТАР-Медиа, 2009. - 656 с. - (Серия «Национальное руководства»).

2. Клиническая иммунология и аллергология / Под ред. Лолора-младшего Г., Фишера Т., Адельмана Д. Пер. с англ. - М.: Практика, 2000. - 806 с.

3. Система цитокинов: Теоретические и клинические аспекты / Под ред. Козлова В.А., Сенникова С.В.. - Новосибирск: Наука, 2004. - 324 с.

4. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Ярилин А.А. Руководство по клинической иммунологии. Диагностика заболеваний иммунной системы / Руководство для врачей. - М: ГОЭТАР-Медиа, 2009, - 352 с.

5. Хайдуков С.В., Зурочка А.В. Проточная цитометрия как современный метод анализа в биологии и медицине <http://elibrary.ru/item.asp?id=9734170> // Медицинская иммунология <http://elibrary.ru/issues.asp?id=8827&selid=445544>, 2007 <http://elibrary.ru/issues.asp?id=8827&jyear=2007&selid=445544>, Т. 9 <http://elibrary.ru/issues.asp?id=8827&volume=9&selid=445544>, N 4-5 <http://elibrary.ru/contents.asp?issueid=445544&selid=9734170>. с. 373-378.

6. Ярилин А.А. Основы иммунологии. - М.: Медицина, 1999. - 607 с.

7. Ярцев М.Н., Яковлева К.П. Иммунная недостаточность: клинико-лабораторная оценка иммунитета у детей // Иммунология, 2005, N 1, с. 36-44.

 

Содержание

 

Предисловие

Введение

1. Области использования иммунодиагностики

2. Иммунологические методы в диагностике заболеваний иммунной системы

2.1 Количественное определение популяций лимфоцитов

2.1.1 Проточная цитометрия

2.1.2 CD-классификация мембранных молекул иммунокомпетентных клеток

2.1.2 Маркеры активации лимфоцитов

2.2 Методы оценки функциональной активности лимфоцитов

2.2.1 Определение пролиферативной способности лимфоцитов

2.2.2 Определение цитотоксической активности Т-лимфоцитов

2.2.3 Оценка ГЗТ in vivo

2.2.4 Оценка цитотоксической активности естественных киллеров

2.2.5 Методы количественного определения иммуноглобулинов

2.3 Методы исследования функций фагоцитов

2.3.1 Методы определения хемотаксиса лейкоцитов

2.3.2 Определение адгезивных свойств

2.3.3 Определение фагоцитарной способности

2.3.4 Оценка бактерицидной активности

2.4 Методы оценки системы комплемента

3. Иммунологические методы, основанные на реакции антиген-антитело

3.1 Иммуноферментный анализ

3.2 Радиоиммунный анализ

3.3 Иммунофлюоресцентный анализ

4. Методы исследования цитокинов

Заключение

Вопросы для самоконтроля

Задания в тестовой форме

Словарь иммунологических терминов

Библиографический список

 

Предисловие

 

Согласно определению ВОЗ клиническая иммунология - это клиническая и лабораторная дисциплина, занимающаяся изучением вопросов диагностики и лечения больных с различными заболеваниями и патологическими состояниями, в основе которых лежат иммунологические механизмы, а также состояниями, в терапии и профилактике которых иммуноактивные препараты играют ведущую роль. Обращает на себя внимание то, что иммунология - это и лабораторная дисциплина. Сложилось так, что иммунологические методы используются очень широко в различных областях медицины. Главным образом, это методы, основанные на иммунных реакциях (антиген+антитело, ГЗТ). Одной из задач клинической иммунологии в современной медицине является обогащение ее иммунологическими подходами к диагностике и лечению заболеваний.

Данное пособие адресовано студентам лечебного и педиатрического факультетов, изучающим клиническую иммунологию, в частности, при подготовке по разделу 2 «Оценка иммунного статуса. Иммунодиагностика», темы 2 «Методы оценки иммунного статуса и их клиническая интерпретация» учебно-методического плана. Пособие содержит развернутый систематизированный материал по данной теме, освещающий возможности современной иммунодиагностики, области использования иммунологических методов в различных областях клинической медицины, методологию иммунодиагностики основных заболеваний иммунной системы, основные иммунологические методы.

Настоящее учебное пособие будет способствовать формированию представлений о принципах иммунодиагностики; приобретению знаний о показаниях для исследования иммунного статуса, количественных и функциональных тестах оценки Т-клеточного, В-клеточного иммунитета, НК-клеток, фагоцитоза, комплемента и их клинического значение, умений определять показания для исследования иммунного статуса, интерпретировать основные показатели иммунного статуса.

Изучение данного вопроса предполагает преемственность и базируется на знаниях, приобретенных студентами на младших курсах при изучении смежных дисциплин (микробиология, общая биология, и др.). В то же время, полученные студентами знания могут быть востребованы при изучении целого ряда других клинических дисциплин образовательной программы (гематология, трансплантология, онкология, инфекционные болезни и др.).

Настоящее пособие посвящено 2 и 3 разделам рабочей программы по дисциплине “клиническая иммунология”.

 

Введение

 

Впервые методология иммунодиагностики заболеваний иммунной системы была разработана в нашей стране Р.В. Петровым и соавторами, опубликовавшими в 1984 г. методические рекомендации «Оценка иммунного статуса человека». В соответствии с этими методическими рекомендациями все методы иммунодиагностики разделены на тесты I и II уровней. Тесты I уровня направлены на идентификацию грубых поломок иммунной системы, т.е. первичных иммунодефицитов; тесты II уровня - на углубленное изучение функционального состояния иммунной системы.

К тестам I уровня относят:

определение функциональной активности фагоцитов;

определение численности основных популяций и субпопуляций лимфоцитов;

определение концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови.

К тестам II уровня относятся:

определение субпопуляций регуляторных Т-лимфоцитов;

тест торможения миграции лейкоцитов с использованием в качестве стимулятора ФГА (фитогемагглютинина);

- оценка пролиферативной активности Т- и В- лимфоцитов на митогены, антигены, аллогенные клетки;

оценка активности киллерных лимфоцитов;

выявление циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК);

- определение различных компонентов комплемента;

- оценка различных этапов фагоцитоза и рецепторного аппарата фагоцитов;

- тесты по определению медиаторов иммунной системы, в том числе продукции и рецепции интерлейкинов;

- анализ генов, ответственных за экспрессию иммунологически значимых молекул.

В пособии приведены современные принципы оценки состояния основных звеньев иммунной системы человека для диагностики нарушений иммунной системы при иммунопатологических состояниях. Представлен краткий обзор современных лабораторных методов, используемых в иммунологии. Также охарактеризованы возможности использования иммунологических методов в различных областях клинической медицины.

лимфоцит антиген иммунодиагностика

 

1. Области использования иммунодиагностики

 

Представляем данные об использовании иммунологических методов в разных областях медицины. Современная диагностика любого инфекционного заболевания основывается на обнаружении возбудителя болезни (бактериологические методы, ПЦР) или на выявлении специфического иммунного ответа на возбудителя (антитела, ГЗТ). Так, в диагностике ВИЧ-инфекции выявление антител с помощью ИФА является скрининговым методом, а подтверждающим - иммуноблотинг, позволяющий идентифицировать антитела к различным антигенам вируса. Все вирусные, многие бактериальные инфекции диагностируют путем выявления специфических антител (IgM и IgG) к поверхностным антигенам микроорганизмов. ГЗТ чаще оценивают in vivо, например, в диагностике туберкулеза.

Эндокринология, гематология и другие области внутренней медицины широко используют иммунологические методы в диагностике.

Верификация опухолевого клона в диагностике онкологических и онкогематологических заболеваний проводится морфологическими методами («золотой» стандарт) и путем фенотипирования опухолевых клеток. Иммунофенотипирование клеток - это определение поверхностных маркёров и, соответственно, принадлежности клеток к той или иной субпопуляции. Традиционные морфологические и цитохимические исследования клеток субстрата болезни (кровь, красный костный мозг, лимфатические узлы, селезёнка и т.д.) во многих случаях, особенно при лимфопролиферативных заболеваниях, не позволяют выявить всё многообразие вариантов среди морфологически сходных форм и установить источник происхождения патологического клона. Эти задачи могут быть решены только путём изучения иммунологической характеристики клеток. При неопластических изменениях блок дифференцировки может произойти на любой стадии нормального развития клеток, в результате чего образуется клон патологических клеток, определяющих субстрат болезни и имеющих одинаковую иммунологическую (или фенотипическую) характеристику. Проведя исследования этих маркёров на клетках, можно определить, какой форме и варианту заболевания они соответствуют, то есть на основе иммунологического фенотипа клеток проводить дифференциальную диагностику, которая наиболее трудна при лимфопролиферативных заболеваниях, потому что основной клеткой патологического субстрата болезни являются морфологически почти однотипные клетки. В диагностике минимальной резидуальной болезни (МРБ) могут использоваться иммунологические методы, в частности, иммунофенотипирование методом проточной цитометрии. Минимальной резидуальной или минимальной остаточной болезнью называют небольшую популяцию опухолевых клеток, которая не может быть зафиксирована с помощью морфологических методов, но обнаруживается более тонкими методами исследования, выявляющими 0,03%- 0,5% клеток аберрантного фенотипа.

Определение концентрации различных биологически-активных веществ: гормонов, онкофетальных антигенов, витаминов и других молекул, не определяемых стандартными биохимическими методами, может осуществляться только на основе иммунологических методов (главным образом, ИФА).

 

2. Иммунологические методы в диагностике заболеваний иммунной системы

 

Для объективной оценки состояния иммунной системы человека введено понятие об иммунном статусе. Иммунный статус - это комплекс показателей, характеризующих субпопуляционный состав лимфоцитов, гуморальный и клеточный иммунитет, фагоцитарное звено, то есть практически всю иммунную систему человека в данный момент времени. Исследование иммунного статуса проводится с целью уточнения диагноза, определения тактики лечения и прогноза при первичных иммунодефицитах, ВИЧ-инфекции и других вторичных иммунодефицитах, аутоиммунных, аллергических заболеваниях.

Иммунодиагностика предполагает идентификацию нарушенного звена иммунной системы, индивидуальна для данного заболевания у конкретного больног