Глава III. Результаты и их обсуждение

 

Лимфоциты являются ключевым звеном иммунной системы и участвуют почти во всех иммунных и аутоиммунных реакциях, очень важна их роль при аллергических реакциях. [3] Обычно при изучении и оценке иммунного состояния организма, а также исследовании молекулярных механизмов, по которым протекают многие заболевания, главным объектом изучения являются лимфоциты.

Поэтому очень важным этапом в проведении таких исследований является получение чистых и жизнеспособных популяций лимфоцитов.

Основные методы выделения лимфоцитов из периферической крови основаны на центрифугировании гепаринизированной крови в градиенте плотности, что позволяет разделить клетки крови в зависимости от их плотности и осмолярности. Первые методы разделения лимфоцитов включали использование фиколла в качестве агента для формирования градиента плотности, преимущество которого видели в отделении лимфоцитов от моноцитов. При этом получали популяции лимфоцитов с достаточно высоким уровнем чистоты. [11]

Мы выбрали методику, которая позволяла разделять мононуклеарные клетки (МНК) и гранулоциты периферической крови человека с высокой степенью дифференцировки. Стандартная методика позволяет легко получить фракцию МНК, но обычно небольшое количество гранулоцитов все-таки остается, так как есть различия в плотностях в группах МНК у различных образцов. Однако разделение может быть улучшено, подбором осмотической концентрации раствора. Авторы работы [12] показали, что например, использование фиколл-изопак при разделении лейкоцитов и гранулоцитов дает высокую степень очистки из крови человека.

Секреторные гранулы из лимфоцитов выделяли методом описанным в работе [13,14] используя градиент плотности перколла. Особенности работы с ультрацентрифугой:

.   Ротор перед употреблением необходимо охладить, т.е. выдержать в холодильнике при температуре центрифугирования.

2. Пробирки с образцами тщательно уравновесить на электронных весах до четвертого знака после запятой.

Немаловажную роль при патологии отводят нуклеазам лимфоцитов.

Ранее было показано, что лимфоциты крови пациентов с астмой имеют характерные морфологические изменения структурных компонентов. Эти изменения являются результатом биохимических реакций.

По данным литературы [15] описана экспрессия ДНКазной активности (это кислая ДНКаза с молекулярной массой 66 кДа активируется ионами Ca²⁺ и ингибируется Zn²⁺, специфична к днДНК) ассоциированной с цитоплазматическими гранулами в активированных CD4+-лимфоцитах человека и участие этих Т-клеток в развитии аутоиммунных заболеваний, что натолкнуло нас на изучение возможного присутствия гранул-ассоциированных ДНКаз в Т-лимфоцитах крови не только пациентов с астмой, но и здоровых людей.

Для этого нам и надо было освоить метод и выделить гранулы из лимфоцитов. В результате была получена фракция, содержащая гранулы, из которой были экстрагированы белки.

Чтобы убедиться, что белки присутствует в белковом экстракте гранул, выделенных из лимфоцитов, мы провели электрофорез (рис.3) и определили их молекулярную массу.

 

1 2 3

1 - белковый экстракт гранул на интермитирующей стадии; 2 - белковый экстракт гранул на персистирующей стадии; 3 - маркеры: 68кДа-БСА, 45кДа - ЯА, 29кДа - карбоангидраза: (окрашивание нитратом серебра);

Рис. 3. Электрофореграмма белков гранул лимфоцитов в полиакриламидном геле.

 

Дорожки 1 и 2 - образцы экстракта гранул, 3 - маркеры.

Молекулярные массы белков из секреторных гранул составляют: 66 069, 63 095, 50 108, 68 000, 60 255 Да.

Выводы

 

1. Освоен метод скоростного и равновесного центрифугирования.

. Освоена работа на ультрацентрифуге Beckman Optima ^TM L-series.

. Освоен метод выделения экстракта секреторных гранул Т-лимфоцитов.

. Освоен метод определения молекулярной массы белков и установлена молекулярная масса белков секреторных гранул Т-лимфоцитов: 66 069, 63 095, 50 108, 68 000, 60 255 Да.

Список литературы

 

1.  Urboniene, D. Autoimmunity in pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease/ D. Urboniene, R. Sakalauskas, B. Sitkauskiene // Medicina (Kaunas). - 2005. - V.41, N.3. - P. 190-195.

.    Kopinski, P. Apoptosis of alveolar lymphocytes in sarcoidosis and in control group is more frequentin smokers then in nonsmoking persons/ P. Kopinski, G. Przybylsk., B. Balicka-Slusarczyk et al // Przegl Lek. - 2006. - V.63. - P.841-847.

.    vignola, a. m. Airway inflammation in mild intermittent and in persistent asthma/ a. m. vignola, p. chanez, a. m. campbell, et al. // am j respire crit care med. - 1998. - v.157. - p.403-409;

4. Ccылка на источник инет

5. Фармация Файн Кемиклз. Каталог продукции 1983. - С. - 71-76.

6. Ccылка на инет

.   Остерман, Л.А. Методы изучения белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование.

.   Невзорова, Т.А. Физико-химические методы в биохимии. 2005 г

.   Ссылка на зи

10. Parrish, J. Z. Cuts can kill: the roles of apoptotic nucleases in cell death and animal development / J. Z. Parrish, X. Deng // Chromosoma. - 2006. - V.115, № 2. - P.89-97.

11. Feucht, HE <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Feucht+HE%22%5BAuthor%5D>. Efficient separation of human T lymphocytes from venous blood using PVP-coated colloidal silica particles (percoll) /HE. Feucht <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Feucht+HE%22%5BAuthor%5D>, M. R. Hadam <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Hadam+MR%22%5BAuthor%5D>, F. Frank <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Frank+F%22%5BAuthor%5D>, G. Riethmuller <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Riethmuller+G%22%5BAuthor%5D>. // J Immunol Methods. <javascript:AL_get(this,%20'jour',%20'J%20Immunol%20Methods.');>. - 1980. - V.38. - P.43

.   Boyum, A. Separation of leucocytes: improved cell purity by fine adjustments of gradient medium density and osmolality/ A. Boyum, D. Lovhaug, L. Trasland et al. // Scand. J. Immunol. - 1991. - V.34. - P.697-712.

13. Podack, E. R. Cytolytic T cell granules. Isolation, structural., biochemical and functional characterization/ E. R. Podack., P. J. Konigsberg // J. Exp. Med. - 1984. - V.1. - P.695-710

14. Kornberg, A. Supplement to DNA replication / A. Kornberg/ - San Francisco: W. H. Freeman & Co, 1982. - P.1-203.

.    Pio, R. Granule associated DNase in T4 and T8 lymphocytes from patients with autoimmune diseases / R. Pio, A. Gonzalez, M. J. Lopez-Zabalza et al. // Biochimica et Biophysica Acta. - 1998. - V.1406. - P.51-61.