Лекция 6 Возбудители анаэробных инфекций

План лекции

1. Анаэробная инфекция

2. Отличия анаэробных и аэробных МО

3. Классификация МО по степени толерантности к О₂

4. Клинически значимые анаэробные МО

5. Характеристика Рода Clostridium

6. C. perfringens

7. Патогенез газовой гангрены

8. 8. C. botulinum

9. Ботулотоксин

10. Clostridium tetani

Анаэробная инфекция - э ндогенная и экзогенная инфекция, обусловленная развитием анаэробных микроорганизмов

Разновидности анаэробной инфекции
- Экзогенная (раневая) анаэробная инфекция развивается при попадании в макроорганизм при травмах и ожогах анаэробных споровых микроорганизмов из внешней среды.
- Эндогенная анаэробная инфекция может развиваться в результате проявления патогенных свойств анаэробными микроорганизмами, входящими в состав нормальной микрофлоры человека.

Отличия анаэробных и аэробных МО
Анаэробы:
1.чувствительны к действию активных форм кислорода
2. погибают в присутствии свободных радикалов кислорода
3. нет ферментов цитохромной цепи (супероксиддисмутаза (СОД), каталаза)
4.могут использовать в качестве питательных субстратов органические вещества, но в отсутствие кислорода
5. брожение или бескислородный тип дыхания

Ферменты цитохромной цепи (СОД, каталаза)
2О^2- +Н₂ ^СОД Н₂О₂ + О₂ ↑
2 Н₂О₂ ^{каталаза} 2 Н₂О + О₂

Типы брожения и бескислородного дыхания
Брожение: 1.маслянокислое, 2. молочнокислое, 3. пропионовокислое и др.;
Бескислородный тип дыхания: 1.сульфатный  и 2.нитратный. Акцептором ĕ служит не О₂ (как в случае кислородного дыхания), а сульфаты или нитраты.

Классификация по степени толерантности к О₂
1) Строгие (облигатные) анаэробы – погибают в течение 1 мин при наличии в среде свободных радикалов О₂. Не растут, если среда содержит 0,5% О₂ (метановые бактерии).
2) Аэротолерантные микроорганизмы – выдерживают 1 час при концентрации О₂ 0,1% (Clostridium perfringens).
3) Умеренные анаэробы или микроаэрофилы. Выживают при содержании О₂ 2-8%, когда О₂ меньше, а СО₂ больше 5-10%.(р.Brucella).
4) Факультативные анаэробы – растут в присутствии О₂ и без него. Для устранения свободных радикалов О₂ включают систему цитохромной цепи, образуется каталаза и СОД (все энтеробактерии).
5) Аэробы – только кислородное дыхание (Bacillus, Leptospira).

Анаэробные микроорганизмы, имеющие клиническое значение

Гр (+) палочки

 

Род Clostridium
Заболевания: газовая гангрена, столбняк, ботулизм, псевдомембранозный энтероколит, некротический энтерит
Нормальная микрофлора: ротовая полость, ЖКТ, вагина
Выделяют: 30 видов при ранениях, ожогах, ампутациях и операциях

Род Clostridium (150 видов)
C. perfringens – выявляют в 80% случаев
C. tetani
C. botulinum
C. septicum
C. sord e llii
C. novyi
C. difficile

Смешанные анаэробные инфекции ПОЛИКУЛЬТУРЫ:
- Смесь клостридий разных видов
- Клостридии и неспорообразующие анаэробы
- Неспорообразующие анаэробы и факультативные анаэробы

Морфологические свойства клеток р. Clostridium  
- Крупные Гр+ палочки
- Ширина 0,6-0,9 мкм, длина 4-9 мкм
- Образуют эндоспоры при глубоком анаэробиозе
- Все клостридии подвижны, кроме C. perfringens!!!!!!!!!!!!

Локализация спор р. Clostridium
А - C. tetani («барабанные палочки»)
Б - C. perfringens (различная локализация)
B - C. botulinum ("теннисные ракетки")

Культуральные свойства р. Clostridium
Условия для развития газовой гангрены: Газовая гангрена развивается при попадании спор Clostridium в некротизирующуюся ткань. Окислительно-восстановительный потенциал этой ткани имеет отрицательный заряд.
Окислительно-восстановительный потенциал (Eh): Eh некротизирующейся ткани -160-180 mV (микровольт), Eh нормальной ткани  +150 mV
Редукторы кислорода (тиогликолевая кислота, хлористый цистеин, аскорбиновая кислота) снижают Eh до -100 mV
Краситель-индикатор ризорцин обесцвечивается при Eh -60 mV

\\Культивирование анаэробов в микроанаэростатах\\

Патогенез газовой гангрены
Газовая гангрена развивается при попадании спор Clostridium в некротизирующуюся ткань:
- Отрицательные значения Eh
- Ферментация углеводов
- Образование: газы, некротизирующий токсин, гиалуронидаза, ДНК-аза, протеиназы
- Расширение зоны некроза → токсинемия →летальный исход

Больного может спасти только специфическая антитоксическая сыворотка!!!

Клинические проявления клостридиальной инфекции: некроз ткани, токсинемия, кишечные инфекции, пищевые отравления, некротический энтерит, целлюлит, воспаление оболочек мышечных тканей и сосудов, колонизация сердечной мышцы, клапанов → эндокардит

Морфологические свойства C. perfringens
- Длина клеток до 8 мкм
- Клетки образуют нити до 140 мкм
- Образуют субтерминальные овальные эндоспоры на щелочных средах с белками
- Неподвижны

Культуральные свойства C. perfringens
- Опт.Тº 35-37ºС, рН 7,2-7,4
- Через 2-4 ч в ЖПС бурное газообразование и токсинообразование
 - Колонии 2-5 мм с зоной гемолиза

\\Культуральные свойства C. perfringens \\

Биохимические свойства C. perfringens
- ферментируют все сахара с образованием кислоты и газа
- пептонизируют молоко
- слабая протеолитическая активность (разжижают желатину)
 - растут на 20% желчи и на 2% NaCl,
- не растут на 6,5% NaCl

АГ свойства, патогенность и токсинообразование C. perfringens
Образуют множество экзотоксинов:
           - главные токсины
           - минорные токсины
Токсины обладают АГ- специфичностью →5 серотипов C. perfringens на основании АГ-специфичности токсинов
Минорные токсины:
γ – Т1 (гамма) – летальный фактор,
δ – Т2 (дельта) – летальный фактор и гемолитические свойства,
η – Т3 (эта) – летальный фактор,
θ – Т4 (тэта) – гемолизин,
κ – Т5 (каппа) – коллагеназа, летальный, некротический фактор, действие усиливается в присутствии цистеина,
λ – Т6 (лямбда) – желатиназа, протеиназа, подавляется цистеином,
μ - Т7 (мю) – гиалуронидаза,
ν – Т8 (ню) – дезоксирибонуклеаза (разрушает ДНК)

Диагностика клостридиозов
Экспресс-диагностика через 2 ч - световая микроскопия:
мазки красят по Граму и определяют подвижность (препарат висячей капли).
Обнаружение большого количества Гр(+) крупных бактерий с обрубленными концами с субтерминальными спорами в совокупности с другими клиническими симптомами дает основание предполагать, что инфекция вызвана бактериями клостридиальной этиологии.
ИФА на токсины с сыворотками

Чувствительность клостридий к АМП Левомицетин Метронидазол Клиндамицин
Обязательно проверить на чувствительность к АМП – культивирование проводят в микроанаэростате (37^оС, 4 часа при 1 атм).

C. botulinum
Ботулизм – тяжелая токсикоинфекция, характеризующаяся специфическими параличами
1896 г. botulus (лат.) - колбаса

\\Клетка C. b otulinum (позитивное окрашивание, ТЭМ)\\

Морфологические свойства   C. botulinum
- клетки Гр+ с закругленными концами, длина 4-9 мкм, образуют субтерминальные и терминальные споры – теннисная ракетка

Антигенные свойства C. botulinum
8 серотипов (деление основано на различии свойств токсинов):
A – наибольшее значение в США
B – наибольшее значение во Франции
C₁, C2,D
E – наибольшее значение в Японии
F – нет в России
G

Среда обитания C. botulinum
Постоянно споры в воде, почве → фрукты, овощи → кишечник человека и животных → с испражнениями в окружающую среду → состояние споры
Нормальная микрофлора ЖКТ животных и рыб
Споры обнаруживают в 9% проб почвы и 4% проб воды

Культуральные свойства
C. b otulinum - строгие анаэробы
Оптимальная температура роста: Для серотипов A, B, C, D - 34-35 ºC, Для серотипов E, F - 26-30 ºC
Токсины частично разрушаются - 80 ºC
Споры серотипов A, B, F – наиболее устойчивы, разрушаются при кипячении в течение 5-6 час.

Устойчивость спор C. b otulinum
Споры серотипов А, В, F- кипячение 5-6 ч
Наименее устойчив серотип Е
Хорошо переносят температуру – 16^оС в течение года, могут прорасти и образовать токсины. Продукты, обсеменение большим числом спор, после размораживания могут оказаться токсичными.

Биохимические свойства C. botulinum
Ферментация сахаров – непостоянный признак
В диагностике исследуют протеолитические свойства:
Серотип А, часть В и F – обладает сильным протеолитическим действием, остальные ±.
Серотип А – разлагает казеин, Е – не разлагает, остальные ±.
Используют специальные среды, содержащие печень и фарш.

Основной патогенетический фактор – экзотоксин (ботулотоксин – нейротоксин). Сначала - протоксин, активация (гидролиз) протоксина эндопротеазами.
Токсин состоит из 2-х частей: L - легкой - Zn²⁺- зависимая протеаза (50 кДа) и Н - тяжелой цепи (100 кДа).  Они связаны S-S мостиками. Н-цепь – якорная, прикрепляется к рецептору клетки, L-цепь – осуществляет специфическое блокирование холинэргической передачи возбуждения в синапсах. Разрушают везикулы, содержащие ацетилхолин, блокируя передачу нервного импульса.

Механизм действия ботулинического токсина (по D. Kedlaya)
Ботулотоксин действует на: 1) двигательные нейроны спинальных моторных центров и продолговатого мозга, вызывая паралич, 2) периферические двигательные нервно-мышечные рецепторы, нарушая передачу возбудителя с нерва на мышцу

Клинические проявления ботулизма: диспепсия, нарушение зрения, нарушение дыхания
При характерных признаках ставят разные диагнозы.

Инкубационный период – 12-24 час – 10 дней. Летальность 1-60%, РФ – 9%. Чем короче инкубационный период – тем тяжелее заболевание.

Clostridium tetani
Возбудитель раневой анаэробной инфекции - столбняка.
Заболевание характеризуется острым течением, параличом ЦНС – судорогами. В ране токсин.
Столбнячная инфекция относится к дремлющим – очень большой инкубационный период. От травмы до заболевания может пройти от нескольких дней до нескольких месяцев.

\\Характерная поза больного столбняком\\

Места обитания C. tetani
в норме в испражнениях человека и животных → на предметы быта, в раны.  С испражнениями попадает в почву, где образует споры, попадая из почвы в организм, вызывает заболевания.
Характерная черта C. tetani – инфекция локализуется в области поврежденной ткани (ранение, ожог, травма).
Остальные виды клостридий быстро распространяются по тканям.

Заболевания, вызываемые C. tetani - десен, зубов, среднего уха, возможна контаминация через иглы, заболевание новорожденных - пупочная культя

Летальность  40%, обусловлена токсинемией, болеют 2% новорожденных.

Морфология Clostridium tetani
- Молодая культура состоит из длинных одиночных, подвижных Гр+ палочек,
- В старой культуре Гр-.
- Образуют круглые терминальные споры – барабанные палочки.

\\Морфология Clostridium tetani " Барабанные палочки" \\Морфология Clostridium tetani\\

АГ структура
O- АГ и Н- АГ, по Н-АГ выделяют 10 серотипов. Экзотоксин идентичен для всех серотипов.

Культуральные свойства
Облигатный строгий анаэроб, опт.Т^о 35-37^оС.
Среда выращивания – для всего рода.
При культивировании - запах жженного рога + газ.
В ЖПС – помутнение через 48-72 часа, растет медленнее, чем C. perfringens.
В среде на 2-7 день - токсин, потом он разрушается.
На ППС – колонии ø 6 мм, прозрачные серо-желтые, через 4-6 дней, S и R формы. В высоких столбиках – вид чечевицы. Гемолиз на кровяном агаре, не растут в присутствие 20% желчи и 6,5% NaCl. Споры гибнут при 100^оС за 1 час.

Биохимические свойства C. tetani
Ферментативные (сахаролитические) свойства – не выражены.
образуют протеазы и РНК-азы, разжижают желатин
C. tetani выделяют экзотоксин → в ЦНС по лимфо- и кровеносным сосудам → приводит к гиперрефлексии и спазму скелетных мышц → столбняк.

Токсины C. tetani
тетанолизин – разрушает эритроциты, обладает летальным действием – это кардиотоксин.
тетаноспазмин – причина спазмов. Смерть наступает при полном сознании от асфиксии и поражения жизненно важных центров. Сначала наблюдается тоническое сокращение жевательных и мимических мышц, потом затылка и спины.

Лабораторная диагностика
Материал для исследований: гной, кровь, секционный материал.
Микроскопия, но даже нахождение Гр+ палочек не дает основания для постановки диагноза, без определения токсина.Обязательно! Определение токсина в клиническом материале и культуре. Диагноз только после проверки сыворотки на мышах.

Профилактика и лечение
Профилактика при ранении: вводят Ig, если не привита вакцина АКДС или вводят анатоксин
Донорский противостолбнячный Ig вводят 1 раз

Лекция 7 Возбудители особо опасных зоонозных инфекций (по 2011 г)

План

1. Возбудители зоонозных инфекций

2. Чума-природно-очаговое заболевание. Резервуары. Пути передачи.

3. Клинические формы и клинические проявления чумы

4. Таксономия р. Yersinia

5. Возбудитель чумы - Yersinia pestis

6. Морфологические свойства

7. Культуральные свойства

8. Антигенные комплексы

9. Факторы патогенности

10. Лабораторная диагностика

11. Возбудители зоонозных инфекций

Особо опасные инфекции (ООИ): Чума – Yersinia pestis
Сибирская язва – Bacillus anthracis
Туляремия – Francisella tularensis
Бруцеллез – p. Brucella

\\Бактериолог – работник противочумной станции\\

Заражение человека при контакте с больными животными, при употреблении зараженных продуктов, при укусе кровососущих насекомых: блох, вшей, клещей, комаров. Некоторые зоонозные инфекции могут передаваться от человека к человеку.

Yersinia pestis – возбудитель чумы

Чума – особо опасное природно-очаговое инфекционное высококонтагиозное заболевание, характеризующееся тяжелой интоксикацией, поражением лимфатической системы, септицемией и септокопиемией

Эпидемии чумы приводили к опустошению целых городов и стран.  1348-1351 – погибло 24 млн. человек

\\Чума-природно-очаговое заболевание\\Площадь эндемических очагов чумы \\

Резервуары Yersinia pestis
Природный: Грызуны: суслики, сурки, тушканчики, песчанки
В городах: мыши, черные крысы
Восприимчивы: верблюды, ежи, лисы, кошки, белые мыши, морские свинки, кролики, обезьяны

Пути передачи чумы
1. Контактный
2. Трансмиссивный
3. Алиментарный
4. Аспирационный

Пути передачи инфекции: азиатская крысиная блоха Xenopsylla cheopis передает чумную палочку от крыс к человеку

Клинические формы чумы:
основные: Бубонная, Легочная
дополнительные: Кишечная, Септическая

Клинические проявления
Общие черты:
Инкубационный период – 2-3 сут. Начало заболевания внезапное – озноб, повышение температуры, головная боль, рвота. Отсутствуют язвы на месте укуса блохи (в отличие от язвенно-бубонной формы туляремии)
Особые клинические проявления:
- Бубонная форма чумы: воспаление регионарных лимфатических узлов, снижение АД, затемнение сознания, бред, "меловой язык"
Патогенез: в бубонах – геморрагическое воспаление, некроз, нагноение, свищ, возможно образование вторичных бубонов

- Легочная форма чумы: боли в грудной клетке (плевропневмония), кашель, выделение кровяной мокроты.
Патогенез: множественные некротические очаги в легких и очаги геморрагической пневмонии.

- Кишечная форма чумы: слизисто-кровяная диарея
Патогенез:множественные некротические и геморрагические очаги в кишечнике

Таксономия рода Yersinia (11 видов)
Сем. Enterobacteriaceae
Наиболее патогенные:
Yersinia pestis – типовой вид
Y. enterocolitica – возбудитель кишечного иерсиниоза
Y. pseudotuberculosis – псевдотуберкулез или скарлатиноподобная лихорадка

Морфологические свойства Yersinia pestis
Гр- палочки, длина – 1,5-2 мкм, ширина -0,5-0,7 мкм, спор и жгутиков не образуют, капсула образуется при 37ºС

\\ Морфология Yersinia pestis (сканирующая электронная микроскопия)\\

Особые тинкториальные свойства - биполярность при окраске метиленовым синим

Культуральные свойства Yersinia pestis
- Факультативные анаэробы
- оpt рН – 6,8-6,9, оpt tºС = 28ºС (психрофил) - холодоустойчивы
- В холодильнике бактерии продолжают размножаться.
- Чувствительны к высоким температурам.
- Гибнет при 100оС – 1 мин., 80оС – 5 мин., 50оС – 40 мин.
- В трупах летом сохраняет жизнеспособность 1 неделю, на холоде – год.
- Устойчивы к высыханию, при лиофилизации сохраняется годами.
-Чувствительны к солнечному свету – гибнет через 2-3- часа.
Рост на ППС - Среда Мартена – характерный:
                     10-12 час - стадия "битого стекла"
                     18 час – стадия "кружевных платочков"
                     24 час – "булавочная головка"

Биохимические свойства Yersinia pestis
На основании биохимических свойств и и с учетом места обитания разделены на расы (варианты): крысиная, сурчиная, сусликовая, полевковая, песчанковая

Антигенные комплексы Y. pestis

I ПОВЕРХНОСТНАЯ ФРАКЦИЯ: FI - капсульная, FIa – белок и полисахарид, FIb – чистый белок

II ПОВЕРХНОСТНАЯ ФРАКЦИЯ: (белково-липидные комплексы) V- цитоплазматическая мембрана, W –наружная мембрана

Факторы патогенности Y. pestis
1. ПИЛИ
2. ФЕРМЕНТЫ: нейраминидаза,фибринолизин, плазмокоагулаза
3. Эндотоксин
4. Эндогенные пурины
5. БАКТЕРИОЦИНЫ - ПЕСТИЦИНЫ

Контроль патогенности - Плазмиды:
pYP – плазмида патогенности
pYT – плазмида токсигенности
pYV – плазмида вирулентности

Лабораторная диагностика (только на противочумных станциях)
1. Бактериоскопия: Окраска по Граму, Окраска метиленовым синим (биполярность), Агглютинация сывороткой (люминесцентный микроскоп)
2. Высев на специальные среды (среда Мартена) при 28^оС. Через 18 часов - стадия «кружевных платочков» 

Чувствительность Y. pestis к АМП тетрациклин  левомицетин   рифампицин  все дезинфицирующие средства

Иммунитет различной длительности, возможны повторные заболевания

Bacillus anthracis - сибирская язва

1. Возбудитель сибирской язвы - Bacillus anthracis

2. Клиническая картина заболевания

3. Эпидемиология

4. Таксономия р. Bacillus. Общие свойства
представителей рода Bacillus

5. Морфологические свойства Bacillus anthracis

6. Культуральные свойства.Условия образования капсул и спор.

7.  Патогенез сибирской язвы. Факторы патогенности

8. B. anthracis

9.  АГ структура. Аллергическая реакция на клетки

10. B. anthracis

11. Лабораторная диагностика

12. Профилактика. Чувствительность к АМП

Антракс – углевик, карбункул (гнойно-воспалительный очаг на коже, в центре которого находится черный струп, похожий на уголь).

Клиническая картина заболевания: Кожная форма – 90%, Легочная, Кишечная, Сепсис при иммунодефиците, Бактериемия при любой форме

Эпидемиология
Источник заболевания у животных:
Дикие и домашние животные: овцы, коровы, лошади, свиньи
Заражение через воду и корм
Висцеральные формы заболевания
Источник заболевания у человека:
проф. заболевания – кожные
Заражение через шерсть, кожу животных

Таксономия р. Bacillus - 20 видов
Bacillus anthracis - описан  Р. Кохом
B. megaterium
B. subtilis
B. cereus

Общие свойства представителей рода Bacillus
- ГР+крупные палочки
- Некоторые подвижны
- Образуют эндоспоры
- Каталаза+
- Чаще строгие аэробы (некоторые факультативные анаэробы)

Для внутривидовой дифференциации используют тесты: Подвижность, Ферментативная активность, АГ-структура, Проверка на биопробах – патогенен только B. anthracis

Морфологические свойства Bacillus anthracis
- ГР⁺палочки
- Ширина 0,6-0,8 мкм, длина 5-8 мкм
- Эндоспоры
- Вне макроорганизма образует цепочки
- Неподвижны

3 морфологические формы:
1. вегетативная бескапсульная
2. вегетативная капсульная – полипептид
3. споровая

Условия образования капсул и спор: Капсула – полипептид, образуется только в макроорганизме. Споры образуются вне организма - в почве или при длительном культивировании, при доступе кислорода, при Opt. tº -30-35ºC

Культуральные свойства Bacillus anthracis
- Неприхотливы к составу питательных сред – МПА
- tº - 12-43ºC, оpt. tº - 37ºC в аэробных условиях
- Через 18-24 ч – на ППС образуют колонии

Характерная морфология колоний - "Голова медузы", "Львиная грива"
Вирулентные в R-форме!!!

\\R-формы колоний B. anthracis \\ Дифференциальные среды для антракоидов-двойников
(сапрофиты B. сereus дают гемолиз) \\

Устойчивость B. anthracis
Вегетативные клетки неустойчивы
Споровые формы гибнут при кипячении 1 час
В 70º спирте сохраняют жизнеспособность 2-3 часа

Биохимические свойства B. anthracis
Аэробы: активно используют сахара с образованием кислоты без газа
Пептонизируют молоко
Каталаза+
Нитратредуктаза+

Патогенез сибирской язвы
Инкубационный период – от нескольких час до нескольких суток. Инфекционный процесс – с момента попадания B. anthracis в ток крови. Распространение по лимфосистеме. Размножение в лимфоузлах

Факторы патогенности B. anthracis
Экзотоксин:
ЗА- защитный (протективный) антиген
ОФ – отечный фактор
ЛФ – летальный фактор
Синергидное действие!!!

Компоненты и принцип действия экзотоксина Bacillus anthracis

 

Схема воздействия экзотоксина

 

АГ структура B. anthracis
О-АГ- соматический полисахаридной природы – реакция Асколи (термопреципетации)
К-АГ- белковой природы (РИФ)

Аллергическая реакция на клетки B. anthracis
Аллерген B. anthracis - АНТРАКСИН (комплекс Б, ПС, НК)

Разработана ретроспективная диагностика: 1 неделя -90% положительных реакций, 15 лет -83% положительных реакций, 30 лет – 70% положительных реакций

Иммунитет при антраксе: B. anthracis иммуногенен, но АТ-образование слабое, сохраняется недолго

Серологические методы не разработаны

Лабораторная диагностика
1. РИФ на определение капсулы
2. Тест с пенициллином (0,05-0,5 мг/мл) «жемчужное ожерелье»
3. Тест на лизис бактериофагами
4. Биопробы

Профилактика - комплекс санитарно-ветеринарных мероприятий
Специфическая – живая споровая бескапсульная вакцина СТИ, авторы Гинзбург и Тамарин

Чувствительность к АМП стрептомицин  пенициллин («жемчужное ожерелье») эритромицин тетрациклин