Передача генетической информации

Механизм распространения бактериальных геновпутем:
1. конъюгации
2. трансдукции
3. трансформации

Мобильный пул генов бактерий состоит из носителей:
1. бактериофаги
2. плазмиды
3. транспозоны
4. геномные «острова патогенности»

"Острова патогенности" – это сегменты бактериальной ДНК, несущие один или несколько генов вирулентности, приобретенные через мобильные генетические элементы: транспозоны, плазмиды или бактериофаги.

Характерные функции «островов» патогенности

 

Вопросы по разделу Задачи и методы клинической микробиологии
1. Определение "клиническая микробиология"
2. 6 групп задач клинической микробиологии
3. Микроскопические методы
4. Культуральные методы
5. Иммунологические методы
6. Иммунологические реакции
7. Диагностические критерии
8. Нарастание титра АТ
9. Молекулярно-биологические методы
10. Неспецифические тесты

Клиническая микробиология – это научная дисциплина, изучающая характер взаимоотношений между макро- и микроорганизмами в норме и, главным образом, в динамике патологического процесса с учетом проводимой антимикробной терапии

Клиническая микробиология самостоятельный статус в 50-60-е гг. XX в. обнаружено и описано много новых возбудителей заболеваний, открыто явление возрастания устойчивости возбудителей к АМ, началась активная разработка методов лабораторной диагностики инфекционных заболеваний

Клиническая микробиология
базируется на клинико-диагностических лабораторных исследованиях инфекционных заболеваний
позволяет лучше понять стратегию и тактику врача при встрече с патологией, вызванной возбудителями инфекционных заболеваний

Задачи клинической микробиологии
1) Оценить природу возбудителя и как можно быстрее идентифицировать его.
уметь отличить возбудителя заболевания от представителя нормальной микрофлоры.
2) Правильно выбрать орган и место, откуда необходимо брать материал у больного на исследование.
Напр., Salmonella typhi, сначала находится в тонком кишечнике, с 10-го дня начала инфекционного процесса персистирует в крови, а на 5-й неделе снова попадает в тонкий кишечник.

3) Соблюдать правила взятия и транспортировки клинического материала от больного.
Например, при подозрении на менингит и коклюш материал берут из верхних дыхательных путей тампоном на проволочке, который загнут под углом 45°. менингит – вверх, коклюш – вниз

4)Правильный выбор условий выращивания возбудителя заболевания. Главная цель - получение чистой культуры.
Нужно подобрать состав питательной среды и условия выращивания (температуру и аэрацию).

5) Выбор соответствующей антимикробной терапии. Желательно еще до получения окончательных результатов лабораторных исследований.
На основании:
- предварительных микроскопических исследований узнать тип строения клеточной стенки (Гр+ или Гр-),
-при выявлении чувствительности микроорганизмов к АМП в процессе выращивания

6)Правильная интерпретация результатов лабораторных исследований с учетом и во взаимосвязи со всем комплексом клинической информации о больном

Основные методы, используемые для решения поставленных  выше задач
1. Микробиологические
2. Иммунологические
3. Молекулярно-биологические
4. Неспецифические лабораторные тесты

 1. Микробиологические методы выявление причины инфекционного процесса
1)Микроскопические
2)Культуральные

1)Микроскопические методы - визуализация возбудителя инфекционного процесса
Прямое исследование патологического материала от больного:
а. световая микроскопия
б. люминесцентная микроскопия
в. электронная микроскопия

а. Световая микроскопия

Цель –морфологическая характеристика возбудителя по форме, размерам, подвижности, наличию спор.
Достоинства–в большинстве случаев очень полезны, т.к. достаточно быстры.
Недостатки -для диагностики имеют лишь ориентировачное значение, а результат расценивается как предварительный.
Световая микроскопия включает:
микроскопию нативного материала – влажные препараты
микроскопия фиксированных, окрашенных препаратов

б. Люминесцентная микроскопия

Мазок обрабатывают не красителем, а сывороткой, содержащей АТ, конъюгированные с флюорохромом. В том случае, если АТ гомогенны АГ микроорганизмов, в люминесцентном микроскопе можно увидеть свечение.
Метод характеризуется высокой специфичностью

в. Электронная микроскопия (ЭМ)
ТЭМ – трансмиссионная (просвечивающая) ЭМ
СЭМ –сканирующая (растровая) ЭМ
ИЭМ – иммунная ЭМ

2) Культуральные методы
Выделение чистой культуры - >Идентификация выделенной чистой культуры
Определение чувствительности бактерий к антимикробным препаратам

Выделение чистой культуры путем посева на питательные среды является основным этапом микробиологического исследования. Успех выделения чистой культуры зависит от правильного выбора питательной среды и условий выращивания.
Идентификация выделенной чистой культуры. После получения чистой культуры проводят идентификацию микроорганизмов по совокупности морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических и антигенных свойств.

\\Идентификация выделенной чистой культуры: Агар Мак-Конки
Используют для выращивания Гр (-) энтеробактерий (лактозопозитивные микроорганизмы окрашиваются в розовый цвет).\\

Определение чувствительности к антимикробным препаратам. Выбор тактики лечения основан на определении чувствительности микроорганизмов к АМП. Выявленная чувствительность in vitro не всегда гарантирует высокую клиническую эффективность in vivo.
Это зависит от ряда причин:
- Приобретение устойчивости к АМП в процессе лечения
- Особенности всасывания АМП клетками слизистой оболочки кишечника
- АМП не могут проникать в очаг воспаления где образуется бактериальная биопленка и т.д.

2. Иммунологические методы

1)Методы поиска антигенов возбудителей инфекционных заболеваний с помощью имеющихся антител.

2) Методы поиска антител – выявление активного иммунного ответа – по нарастанию титра АТ (используют диагностикумы).
Это методы серодиагностики и аллергодиагностики
Достоинства серодиагностических методов: Высоко чувствительные, Быстрые, Достаточно дешевые.
Недостатки серодиагностических методов: В большинстве случаев - ретроспективный характер, нельзя получить информацию о чувствительности возбудителя к АМП.
Применение серодиагностики для оценки эффективности лечения возможно только при хронических формах заболевания.

Для серодиагностики применяют иммунологические реакции
РН – реакция нейтрализации
РСК – реакция связывания комплемента
ИФА – иммуноферментный анализ
РИФ – реакция иммунофлюоресценции
РНГА – реакция непрямой гемагглютинации
ИЭМ – иммунная электронная микроскопия

Диагностические критерии
Только в некоторых случаях (гепатит или сифилис) сам факт обнаружения АТ имеет диагностическое значение
Чаще диагноз ставят на основании нескольких диагностических критериев:
1. Диагностический титр АТ (Д-титр);
2. Нарастание титра АТ

Диагностический титр АТ – Д-титр - условная величина, обозначающая количество АТ в сыворотке крови к конкретному возбудителю.
Превышение определенного уровня АТ может быть расценено как признак заболевания.
Величина Д-титра устанавливается эмпирическим путем для каждого заболевания и для каждой серологической реакции. Д-титры могут не совпадать при обследовании различными серологическими методами.

Современные методы серодиагностики позволяют получать информацию о наличии Ig разной специфичности

Нарастание титра АТ

3. Молекулярно-биологические  методы

Методы выявления ДНК или РНК возбудителя (ПЦР) PCR
Методы определения структуры 16S рРНК малой субъединицы бактериальной рибосомы – метод риботипирования
ПЦР (PCR) - Полимеразная цепная реакция -метод выявления ДНК или РНК возбудителя

ПЦР Разработал амер. исс.- Кэрри Муллис, Ноб. лауреат 1993г.
1985г. in vitro - репликация участков ДНК.

Цель - обнаружение незначительных количеств ДНК (вирусной, бактериальной, простейших) в клиническом материале от больного.
Не является абсолютно точным (случаются ошибки), но он очень специфичен, т.к. основан на уникальном свойстве ДНК – комплементарности, при этом должно произойти взаимодействие участков ДНК возбудителя из клинического материала от больного и имеющихся в диагностическом наборе фрагментов ДНК-возбудителя – праймеров.

Метод PCR включают несколько этапов
1. выделение ДНК
2. амплификация
3. детекция

Материал: кровь, любая ткань, моча, кость, соскобы со слизистых специальными щеточками.
Идентификация останков тоже осуществляется этим способом, т.к. в костях ДНК сохраняется много десятков лет.
Этот этап очень ответственный, необходимо использовать специальные приемы для взятия материала, правильной транспортировки. Лучше всего брать материал и сразу же проводить исследование.
Амплификация - умножение ДНК возбудителя из клинического материала. 25-35 циклов умножения. Теоретически можно иметь всего 1 копию ДНК возбудителя в клиническом материале и ее размножить.
Детекция - определение интересующих фрагментов ДНК – нуклеотидов.

Комплект для PCR  
ДНК-возбудителя из кл. материала – фрагмент нуклеотидов, который нужно определить.
Смесь нуклеотидов – супермикст, из которых будет строиться новые, вновь синтезируемые фрагменты ДНК.
Затравки-праймеры – искусственно синтезированные фрагменты ДНК (олигомеры), Соответствующие фрагментам ДНК определенных возбудителей. Они нужны для того, чтобы начался синтез новой цепочки ДНК только в том случае, если ДНК-возбудителя из клинического материала комплементарно совпадет с ДНК-затравкой, соответствующей ДНК предполагаемого возбудителя.
ДНК-полимераза (термостабильная) – фрагмент, сшивающий нуклеотиды (из термофильной бактерии Thermus aquaticus).

Условия проведения ПЦР
Объемы реактивов, используемые в работе:
Объем супермикса – 20 мкл
Объем ДНК-полимеразы – 20 мкл
Обязательное условие – соблюдение идеальной чистоты!!!

Этапы амплификации
- 1-й этап денатурация (ДНК возбудителя из клин. материала)
Т° = 94°С → 2 цепочкирасходятся, рвутся водородные связи между азотистыми основаниями →1-цепочечные молекулы ДНК.
С этого момента 1-цеп. молекулы ДНК возбудителя называются – амплификатор 1 и 2.
- 2 этап - связывание (отжиг) праймеров к амплификатору
амплификатор 1 связывается с праймером 1, амплификатор 2 с праймером 2
Связывание происходит в случае комплементарного совпадения участка праймера с амплификатором. Праймеры должны соответствовать предполагаемым возбудителям.
При 62°С.
3-й этап – синтез новой цепи ДНК
ДНК достраивается из нуклеотидов супермикста. Строится ампликон. Именно эту реакцию осуществил Кэрри Муллис в 1985г.
Скорость синтеза – 1 нуклеотид/ 1 мин. Все повторяется примерно 30 раз. Занимает 2,5 часа.
При 72°С (оптимальная температура для работы термостабильной ДНК-полимеразы.

Детекция - существует несколько способов:
Электрофорез в агарозном геле
ДНК – гибридизация
ИФА на микрочастицах

PCR характеризуется 2 важными параметрами
Высокая чувствительность
Высокая специфичность

Чувствительность зависит от
- Интенсивности инфекционного процесса
- Правильного отбора проб
- Сроков и условий транспортировки материала
- Правильного выделения ДНК из материала
- Качества реактивов
- Точности этапа амплификации
- Эффективности системы детекции результатов

Неспецифические тесты

Обнаружение в исследуемом материале продуктов метаболизма бактерий (обнаружение токсинов при ботулизме)

Неспецифические тесты, по характеру отклонения которых можно судить о наличии патологических изменений, специфических для инфекционного процесса определенной этиологии (нарастание активности трансаминазы)