Протеолитические свойства микробов

Протеолитические свойства проявляются выделением во внешнюю среду протеолитических ферментов, которые расщепляют белки до промежуточных продуктов (пептоны, полипептиды, аминокислоты) или до продуктов конечного распада (индол, сероводород, аммиак и др.)

Для выявления протеолитических ферментов исследуемую культуру засевают в питательную среду, содержащую тот или иной белок (МПЖ, молоко и др.)

Посевы в МПЖ культивируют 5…7 суток при комнатной температуре, так как желатин расплавляется в термостате. Микробы, обладающие протеолитическими свойствами, разжижают желатин. Многие протеолитические микроорганизмы дают разный характер разжижения: послойное (идущее ровно, сверху вниз), воронкообразное, кратерообразное, реповидное, в форме чулка и т.д.; микроорганизмы, не обладающие протеолитической способностью, дают в МПЖ рост без разжижения желатина.

Для обнаружения сероводорода делается посев уколом (внутрь столбика) по стенке в агар с ацетатом свинца (МПА с 5% пептона и 0,25% ацетата свинца) или в пробирку с МПБ, в которую под пробку над средой помещается полоска стерильной фильтровальной бумаги, пропитанной раствором ацетата свинца. Если исследуемая культура при разложении белка выделяет сероводород, то появляется темно-бурое окрашивание (почернение) по месту укола в плотной среде или на фильтровальной бумажке (в МПБ).

Определение аммиака начинают с того, что под пробирку с бульонной культурой помещают розовую лакмусовую бумажку, культуру термостатируют при 37⁰С в течение 1…3 суток. При наличии аммиака лакмусовая индикаторная бумажка приобретает синюю окраску.

Редуцирующую способность определяют посевом культуры на молоко с метиленовым синим. К стерильному молоку добавляют по капле 1%-ный водный раствор метиленового синего до голубого окрашивания. После культивирования засеянного материала бактерии, обладающие редуцирующей активностью, обесцвечивают лакмусовое молоко (под редукцией понимают химический процесс, заключающийся в отщеплении от вещества кислорода или присоединении к нему водорода).

Для определения каталазы в 3…5 суточную бульонную культуру, выращенную в пробирке, вносят 1 см³ 3%-ного раствора пероксида водорода. При наличии фермента каталазы обнаруживают обильное выделение пузырьков отщепленного кислорода, т.е. образуется так называемая «пенистая шапка».

 

Приготовление бактериальной суспензии

В качестве источника углерода, используемого прокариотическими микроорганизмами в конструктивно-энергетическом обмене является жир и СПАВ. Приготовленную синтетическую среду подвергаем дробному автоклавированию (1; 0.5; 0.5 МПа) в течение 30 мин. По истечении данного времени, среды разливали в стерилизованные конические колбы по 50 см³.

Для получения биомассы исследуемой культуры микроорганизмов, выделенной в первой серии эксперимента, делаем посев на скошенный агар.

Подготовленные таким образом культуры инкубируем в термостате 24 ч при температуре (40±0,5)°С, по окончании чего в пробирки с микроорганизмами вводили 5 см ³ соответствующей жидкой синтетической среды, осуществляя процесс механического воздействия. Приготовленную таким образом бактериальную суспензию вносим в колбы, содержащие по 50 см³ соответствующей синтетической среды. Культивирование микроорганизмов проводили в течение различного времени при температуре (40±0,5)°С при переменном механическом воздействии, осуществляемом на Shaker Type, с частотой колебаний 250 об/мин, амплитудой 6 по 2 ч в сутки.

 

Определение мутности

Мутность определяют фотометрическим способом на приборе КФК-2-УХЛ-4.2 при D²₅₄₀ и толщине поглощаемого слоя 30 мм. Стандартным раствором является дистиллированная вода.

 

Высаливание фермента

В колбу отбирают 50 см³ бактериальной суспензии, добавляют 30% от ее массы сульфата аммония, перемешивают. Раствор и образующийся осадок переносят в патроны и устанавливают в центрифугу марки ЦЛН-2. Продолжительность вращения 15 мин со скоростью 5000 об/мин. После чего образовавшийся осадок собирают в бюкс.

 

Биуретовый метод по Ярош

Метод используется для определения раствора белков с концентрацией от 0,04 до 1,6 мг/см³.

В пробирку наливают 2,4 см³ раствора мочевины, 0,1 см³ раствора белка и 2,5 см³ биуретового реактива. Смесь хорошо перемешивают и пробирки помещают в водяную баню или в термостат при 40⁰С на 10 мин. Затем их охлаждают до 20⁰С. Через 30 мин после добавления биуретового реактива раствор колометрируют при длине волны 540 нм. Количество белка находят по калибровочной кривой, составленной по яичному альбумину (рис. 1).

Для построения калибровочной кривой готовят исходные водные растворы с содержанием 15,20,25,30,35,40 и т.д. мг белка в 10 см³. Из полученных растворов отбирают в пробирки по 0,1 см³, добавляют 2,4 см³ раствора мочевины и 2,5 см³ биуретового раствора и ведут определений описанным выше методом.

 

2.2.10 Определение активности липазы (модифицированный метод Ота, Ямада)

За единицу ферментативной активности липазы принимают такое количество фермента, которое освобождает 1 мкмоль олеиновой кислоты из 40%-ной эмульсии оливкового масла при рН 7,0 и t=37°С в течение 1 ч.

Метод основан на определении путем титрования щелочью жирных кислот, образовавшихся под действием липазы при использовании в качестве субстрата оливковое масло.

Для проведения этого анализа необходимы следующие реактивы: раствор оливкового масла (субстрат), 2%-ный раствор поливинилового спирта, 1н раствор соляной кислоты, 0,05н раствор щелочи, фосфатно-цитратный буфер с рН 7,0, 1%-ный раствор фенолфталеина, 90%-ный раствор спирта, 1%-ный раствор фермента.

Приготовление субстрата. 100 см³ оливкового масла смешивают со 150 см³ 2%-ного раствора поливинилового спирта в эмульсаторе. Полученную эмульсию выдерживают на льду в течение 60 мин. Если расслаивания не наблюдается, субстрат пригоден к использованию.

Приготовление раствора поливинилового спирта. 20г спирта помещают в мерную колбу на 1 дм³ и добавляют 800 см³ дистиллированной воды. Суспензию выдерживают в течение 30 мин при комнатной температуре, затем добавляют 0,5 см³ 1н раствора соляной кислоты и непрерывно перемешивают при температуре 80–90°С в течение 1 ч. Затем раствор охлаждают, доводят до рН 7,0 раствором щелочи, объем доводят до 1 дм³ дистиллированной водой и полученный раствор фильтруют.

5 см³ эмульсии – субстрата и 4 см³ буфера с рН 7,0 помещают в колбу на 100 см³, которую закрывают пробкой. Смесь выдерживают на водяной бане при температуре 37°С в течение 10 мин. Затем к смеси добавляют 1 см³ раствора фермента и хорошо перемешивают. Полученную смесь выдерживают при температуре 37°С в течение 60 мин, после чего немедленно добавляют 30 см³ этанола для прекращения реакции. Раствор титруют 0,05н раствором щелочи в присутствии 1%-ного раствора фенолфталеина до появления окраски.

Контрольную пробу готовят следующим образом. К смеси субстрата и буфера с рН 7,0, выдержанной при температуре 37°С добавляют 30 см³ этанола, затем 1 см³ ферментного раствора и смесь немедленно титруют.

Разность между результатами титрования контрольной и опытной проб соответствует количеству 0,05н раствора щелочи, которое пошло на нейтрализацию жирных кислот, образовавшихся из оливкового масла под действием фермента.

Липазную активность фермента ЛС (в ед/г) определяют по формуле (1):

 

А ´Т

ЛС =– ´ 50, (1)

В

 

где ЛС – липазная активность фермента, ед/г;

А – разность между результатами титрования опытной и контрольной проб, см³;

Т – титр щелочи;

В-концентрация образца ферментного раствора, г/см³.