Методы исследования вирусов.

Исторически вирусология отпочковалась от микробиологии, и хотя микробиологическая техника не могла быть использована при работе с вирусами, такие общие принципы, как правила асептики, получение чистых линий, методы титрования и, наконец, вакцинации, легли в основу новой науки. Дальнейшее изучение наиболее важных свойств вирусов потребовало разработки ряда специальных методов. Так, способность вирусов проходить через бактериальные фильтры стала использоваться для определения их размеров и очистки, малые размеры вирусов стимулировали создание более совершенных методов микроскопии. Технический арсенал вирусологии постепенно обогащается методами физики, химии, генетики, цитологии, молекулярной биологии и иммунологии.

Вирусы удалось измерить и взвесить, определить их химический состав, закономерности размножения, место в природе, роль в возникновении болезней, а также разработать эффективные методы борьбы с вирусными инфекциями. Вирусы выращивают специальными методами, путем заражения лабораторных животных, куриных эмбрионов и культура тканей. На заре вирусологии исследования проводились на лабораторных животных (белых мышах, морских свинках, кроликах). Им вводили «подозрительный материал» и по картине заболевания судили, какой вирус его вызывал. Для размножения и выделения вирусов, кроме лабораторных животных стали использовать развивающиеся куриные эмбрионы, в которых хорошо размножаются некоторые вирусы, накапливаясь, порой до значительных количеств.

С начала 50-х годов XX века был разработан метод культуры тканей: клетки живой ткани разделяют с помощью ферментов, переносят в специальную стерильную посуду, добавляют сложную по составу питательную среду и ставят в термостат для роста. Клетки начинают делиться и постепенно покрывают поверхность стекла ровным сплошным слоем. Если такие клетки заразить вирусом, то можно непосредственно наблюдать их разрушительное действие. Метод культуры тканей позволил открыть новые вирусы и изучить взаимодействие вирусов и клеток.

Выделение, размножение и определение видовой принадлежности вирусов являются основными методами практической вирусологии. Эта работа состоит обычно из двух основных частей: изучения клеток, зараженных вирусом, и исследования выделенных вирусов.

Для обнаружения зараженных клеток используются различные приемы вирусологической диагностики: метод флюоресцирующих антител, позволяющих четко определять наличие вирусов в клетках, которые внешне выглядят незараженными; метод учета скорости и характера размножения вирусов, основанный на разрушении (полном или частичном) клеток. Важную роль в диагностике вирусных инфекций играет определение титров специфических антител в сыворотке больных с помощью различных иммунологических реакций – нейтрализации, связывания комплемента, задержки гемагглютинации и др.

ΙΙ. Особенности строения и размножения вирусов

Рисунок 2.

Долгое время о существовании вирусов судили по их болезнетворному действию. Непосредственно увидеть вирусы удалось лишь после изобретения электронного микроскопа, дающего увеличение в десятки и сотни тысяч раз. Это произошло примерно через 50 лет после открытия вирусов.

Самые крупные вирусы приближаются по размерам к небольшим бактериям, самые мелкие – к крупным белковым молекулам, например, к молекуле гемоглобина крови. Иными словами, среди вирусов есть свои великаны и карлики. Для измерения вирусов используют условную величину, называемую нанометром (нм). Один нанометр составляет миллионную долю миллиметра. Размеры разных вирусов варьируют от 20 до нескольких сотен нм. Для сравнения приведем величину самых мелких кровяных клеток – эритроцитов, равную 7000-8000 нм, т.е. вирусы меньше эритроцитов в десятки и сотни раз. По внешнему виду тельца вирусов напоминают кубики, палочки, шарики, многогранники и нити.

Простые вирусы состоят из белков и нуклеиновой кислоты. Наиболее важная часть вирусной частицы – нуклеиновая кислота – является носителем генетической информации. Если клетки человека, животных, растений и бактерий всегда содержат два типа нуклеиновых кислот – дезоксирибонуклеиновую – ДНК и рибонуклеиновую – РНК, то у разных вирусов обнаружен, лишь один тип – или ДНК, или РНК, что положено в основу их классификации. Второй обязательный компонент вириона – белки отличаются у разных вирусов, что позволяет распознавать их с помощью иммунологических реакций.

Более сложные по структуре вирусы, кроме белков и нуклеиновых кислот, содержат углеводы, липиды. Для каждой группы вирусов характерен свой набор белков, жиров, углеводов и нуклеиновых кислот. Некоторые вирусы содержат в своем составе ферменты.

Каждый компонент вирионов имеет определенные функции: белковая оболочка защищает от неблагоприятных воздействий, нуклеиновая кислота отвечает за наследственные и инфекционные свойства и играет ведущую роль в изменчивости вирусов, а ферменты участвуют в их размножении. Обычно нуклеиновая кислота находится в центре вириона и окружена белковой оболочкой, как бы одета в нее. Капсид состоит из определенным образом уложенных однотипных белковых молекул, которые образуют симметричные геометрические формы вместе с нуклеиновой кислотой вирусов. В случае кубической симметрии нуклеокапсида нить нуклеиновой кислоты свернута в клубок, а капсомеры плотно уложены вокруг нее. Так устроены вирусы полиомиелита, ящура, аденовирусы, реовирусы, риновирусы и др. при спиральной (палочковидной) симметрии нуклеокапсида нить нуклеиновой кислоты вируса закручена в виде спирали, каждый ее виток покрыт капсомерами, тесно прилегающими друг к другу. Структуру капсомеров и внешний вид вирионов можно наблюдать с помощью электронной микроскопии.

Рисунок 3. – Схема строения вируса иммунодефицита человека (1 – капсомеры; 2 – геном; 3 – липопротеиновая оболочка (суперкапсид); 4 - гликопротвиды)

У сложно устроенных вирусов сердцевина в виде туго свернутой спирали покрыта одной или несколькими внешними оболочками, в состав которых входят различные вещества. Такое строение имеют, например, вирусы оспы, гриппа и парагриппа. Особенно подробно изучено строение вирусных бактерий – бактериофагов (фагов), которые состоят из головки и хвоста. Хвост фага одет белковым чехольчиком, от которого отходят длинные тонкие волокна, играющие роль присосок при прикреплении частицы фага к бактерии.

Размножение вирусов.

Вирусы относятся к абсолютным паразитам. Это означает, что они не могут существовать, не принося вреда. Основная сфера деятельности вирусов – клетки, которым любая встреча с вирусом не сулит ничего хорошего. Образно говоря, вирусы убивают тех, кто их кормит, но делают это, не сразу, а размножаясь. Рассмотрим простейший пример размножения вирусов. Представим себе некий обобщенный вариант вирусной частицы, состоящей из двух основных компонентов – нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК), заключенной в белковый чехол (оболочку). Встреча вируса с клетками начинается с его адсорбции, т.е. прикрепления к клеточной стенке, плазматической мембране клетки. Причем каждый вирион способен прикрепляться лишь к определенным клеткам, имеющим специальные рецепторы. На одной клетке могут адсорбироваться десятки и даже сотни вирионов. Затем начинается внедрение или проникновение вируса в клетку, которое осуществляет она сама. Этот процесс называется виропексисом. Клетка как бы «втягивает» прикрепившиеся вирионы внутрь. Более просто устроенные бактерии не способны сами захватывать вирионы из окружающей среды. Этим, по-видимому, и можно объяснить наличие у поражающих их вирусов (бактериофагов) сложного и совершенного аппарата, подобно шприцу, впрыскивающего нуклеиновые кислоты.

Следующий этап – «раздевание» проникших внутрь клеток вирионов. Для этой цели используется имеющийся в клетках комплекс специальных ферментов, которые растворяют белковый чехол вируса и освобождают его нуклеиновую кислоту. Последняя по клеточным каналам проникает в ядро клетки или остается в цитоплазме клетки. Она не только «руководит» размножением вируса, но и определяет его наследственные свойства. Нуклеиновая кислота вируса подавляет собственный обмен клетки и направляет его на производство новых компонентов вируса. С помощью полимераз снимаются копии родительской нуклеиновой кислоты. Часть вновь образовавшихся копий соединяется с рибосомами, на которых осуществляется синтез вирусных белков.

После того как в зараженной клетке накопится достаточное количество компонентов вируса, начинается сборка вирионов потомства или, выражаясь научным языком, процесс композиции. Процесс этот происходит обычно вблизи клеточных оболочек, принимающих иногда в нем непосредственное участие. В составе вновь образовавшихся вирионов часто обнаруживаются вещества, характерные для клетки, в которой размножается вирус. В этих случаях формирование вирионов завершается своеобразным обволакиванием их слоем клеточной мембраны.

Последним этапом взаимодействия вирусов с клетками является выход, или освобождение, новых дочерних вирионов из клетки. Для энтеровирусов характерен быстрый выход в окружающую среду сотен, а порой тысяч дочерних вирионов. Другие вирусы человека и животных (вирусы герпеса, реовирусы, ортомиксовирусы) выходят из клеток по мере созревания. До гибели клеток эти вирусы успевают проделать несколько циклов размножения, постепенно истощая синтетические ресурсы клеток. В отдельных случаях вирусы могут накапливаться внутри клеток, образуя кристаллоподобные скопления, которые называют тельцами включений.

При гриппе, бешенстве, оспе такие тельца находят в цитоплазме клеток, при весенне-летнем энцефалите – в ядре, при некоторых инфекциях – и в ядре, и в цитоплазме.

Высокая специфичность внутриклеточных включений при вирусных заболеваниях позволяет использовать этот признак для диагностики. Например, обнаруженные в клетках головного мозга цитоплазматические включения являются основным доказательством заболевания бешенством, а специфические образования круглой или овальной формы, обнаруженные в эпителиальных клетках, указывают на заболевание оспой. Включения описаны также при энцефалите, ящуре и других заболеваниях. Очень своеобразные включения, имеющие кристаллическую форму, образуют вирусы растений.

Таким образом, размножение вирусов происходит особым, ни с чем не сравнимым способом. Сначала вирионы проникают внутрь клеток, и освобождаются вирусные нуклеиновые кислоты. Затем «заготавливаются» детали будущих вирионов. Размножение заканчивается сборкой новых вирионов и выходом их в окружающую среду. Выпадение любого из указанных этапов приводит к нарушению нормального цикла и влечет за собой либо полное подавление размножения вирусов, либо появление неполноценного потомства.

Поразительно, как вирусы, которые в десятки и даже сотни раз меньше клеток, умело и уверенно распоряжаются клеточным хозяйством. Для построения себе подобных они используют клеточные материалы и энергию. Размножаясь, они истощают клеточные ресурсы и глубоко, часто необратимо, нарушают обмен веществ, что в конечном счете является причиной гибели клеток.

ΙΙΙ. Многообразие вирусов и типы вирусных инфекций

В основу классификации вирусов положены следующие признаки: тип нуклеиновой кислоты (ДНК- или РНК-содержащие вирусы), размер, строение, наличие или отсутствие липидов и др. Основные группы вирусов, вызывающих заболевания у человека, представлены в таблице.

Таблица - Вирусы, опасные для человека

Основные семейства, роды вирусов, отдельные вирусы	Размер вирусов в нанометрах (нм)	Число типов вирусов, встречаю-щихся в природе	Число типов вирусов, патогенных для человека	Вероят-ность встречи с вирусом (в %)	Болезни, вызываемые вирусами

ДНК-содержащие вирусы

Семейство вирусов оспы 300-450 >50 1 Неизве-стно Оспа человека и животных

Семейство вирусов герпеса	120-200	>30	5	90-100
Вирус герпеса тип 1	120-200	1	1	50-70
Вирус герпеса тип 2	120-200	1	1	10-70

Болезни глаз, слизистых оболочек, кожи; иногда опухоли и энцефалиты Вирус ветряной оспы 120-200 1 1 100 Ветряная оспа Цитомегаловирус 120-200 1 1 90 Цитомегалия Вирус Эпстайна-Барра 120-200 1 1 Неизве-стно Опухоли гортани Гепадновирусы 120-200 1 1 10-15 Гепатит В (сывороточный гепатит) Семейство аденовирусов 70-90 34 7 90 Острые респираторные заболевания, болезни глаз Род папилломави-русов 45-55 9 3 50 Бородавки Род полиомавиру-сов 45-55 5 2 10-30 Энцефалопатии, возможно опухоли

РНК-содержащие вирусы

Семейство рабдовирусов 50-95 30 8 10-30 Бешенство, везикулярный стоматит Семейство коронавирусов 75-160 9 3 50-70 Острые респираторные заболевания Семейство парамиксовирусов 150 20 6 100 Острые респираторные заболевания Вирус паротита 150 1 1 100 Эпидемический паротит (свинка) Вирус кори 150 1 1 100 Корь Семейство ортомиксовирусов 80-120 3 3 100 Грипп А, В, С Семейство буньявирусов 90-100 >200 >50 Неизве-стно Энцефалиты, москитные лихорадки Семейство ретровирусов 80-100 >20 Неизвестно Неизве-стно Предполагаемые возбудители рака, саркомы, лейкозов Семейство реовирусов 60-80 80 20 20-50 Острые респираторные заболевания Род ротавирусов 60-80 2 2 100 Острые гастроэнтериты Семейство тогавирусов 40-70 Более 200 Около 400 Неизве-стно Энцефалиты, геморрагические лихорадки Род вирусов краснухи 60-75 1 1 85 Краснуха Семейство пиконавирусов 20-30 169 169 40-70   Энтеровирусы 20-30 30 30 40 Полиомиелит Вирусы Коксаки А и В 20-30 29 29 40 Миокардиты Риновирусы 20-30 110 110 70 Острые респираторные заболевания Вирусы гепатита А 20-30 1 1 40 Гепатит А (инфекционный)

Как видно из приведенных данных, из более чем 1000 вирусов, выделенных от человека и животных к настоящему времени, около половины обладает болезнетворными свойствами. При этом вирусы действуют избирательно, обычно поражая определенные органы и ткани кишечника, миндалины, печень, нервные клетки спинного или головного мозга, поэтому болезни, которые они вызывают (энтериты, острые респираторные заболевания, гепатиты, энцефалиты и др.), как правило, имеют определенную клиническую картину.

Для большей полноты упомянем некоторые вирусы, вызывающие болезни животных, имеющие важное значение для ветеринарии. По строению и основным свойствам эти вирусы очень напоминают приведенные в таблице вирусы человека, хотя они паразитируют в клетках домашних и диких животных, птиц, рыб и насекомых. Среди них различают большую группу вирусов оспы обезьян, коров, верблюдов, буйволов, коз, кроликов, мышей, различных птиц и насекомых; аденовирусы быков, лошадей, свиней, овец, собак, кур, гусей, уток; герпесвирусы обезьян, аборта лошадей, свиней, крыс и кур; реовирусы обезьян, летучих мышей, овец, птиц; тогавирусы, вызывающие энцефаломиелиты лошадей, чуму свиней, геморрагическую лихорадку обезьян; коронавирусы, вызывающие бронхит кур, гепатит Машей, энцефалит свиней и др.; парамиксовирусы коров, овец, индюков, зябликов, попугаев, пневмонии овец, чумы собак и др.; ретровирусы, вызывающие лейкозы крупного рогатого скота, саркомы кошек и птиц, рак молочных желез мышей и др.; пикорнавирусы, вызывающие полиомиелит и энцефаломиокардит у мышей, ящур и т.д.

Диапазон патологических процессов, вызываемых вирусами, очень широк (таблица). Здесь и так называемые генерализованные инфекции (грипп, корь, бешенство, свинка, оспа и др.), и местные поражения кожи и слизистых оболочек (герпес, бородавки), и болезни отдельных органов и тканей (миокардиты, гепатиты, лейкозы), и, наконец, злокачественных новообразования (рак, саркома у животных). Использование антибиотиков резко снизило число заболеваний, вызываемых бактериями и простейшими. Это привело к тому, что удельный вес вирусных инфекций в патологии человека начал возрастать. Распространенными заболеваниями остаются грипп и острые респираторные заболевания, корь, вирусный гепатит, тропические лихорадки, герпес и другие вирусные болезни. В природе существует мало чисто человеческих вирусов; все они близки и аналогичны соответствующим вирусам животных.

Р

исунок 4 – Вирус гепатита В

Какова вероятность встречи с вирусами? С возбудителями гриппа, кори, свинки (см. Паротит эпидемический), герпеса, цитомегалии, гастроэнтерита и различных ОРЗ (см. Острые респираторные заболевания) контакты практически неизбежны (90-100%); с вирусами, вызывающими гепатит (см. Гепатит вирусный), краснуху, бешенство, везикулярный стоматит, полиомиелит, миокардиты, синдром приобретенного иммунного дефицита (СПИД), встреч можно избежать. Так или иначе, но человек на протяжении всей жизни подвергается опасности заразиться и заболеть какой-либо вирусной инфекцией, хотя существует определенная возрастная чувствительность к вирусам.

Еще не родившемуся плоду человека грозят два вируса – краснухи и цитомегалии, которые передаются внутриутробно и очень опасны. Новорожденные и грудные младенцы еще более уязвимы: им угрожают вирусы герпеса 1-го и 2-го типа и вирус гепатита В, подстерегают их и новые опасности – грипп, различные ОРЗ, полиомиелит, острые гастроэнтериты. Однако особо высокой чувствительностью отличаются дети младшего и старшего возраста. Они восприимчивы, по сути дела, ко всем вирусным инфекциям, и в первую очередь, к кори, эпидемическому паротиту и гепатиту А. Перед людьми зрелого возраста вирусы несколько отступают «отступают» - взрослых людей они поражают гораздо реже, но в отношении пожилых и стариков активизируются вновь.

Итак, вирусы являются постоянными спутниками человека от рождения (вернее, еще до рождения) вплоть до глубокой старости. Считается, что при средней продолжительности жизни 70 лет около 7 лет человек более вирусными заболеваниями. Отсюда понятно, что вирусы приносят огромный экономический ущерб. Так, ежегодные потери, связанные только с гриппом, составляют в нашей стране миллиарды рублей. Если же сюда прибавить потери, связанные с другими вирусными инфекциями, в частности поражающими сельскохозяйственных животных (ящур, чума кур, лейкозы коров и др.) и растения (рак картофеля, карликовость помидоров, мозаика табака и т.д.), эта сумма возрастает во много раз. Но вернемся к людям. Подсчитано, что в среднем человек ежегодно сталкивается с 2 и более вирусными инфекциями, а всего за жизнь вирусы до 200 раз проникают в его организм. К счастью, далеко не все эти встречи заканчиваются болезнями, так как в процессе эволюции человеческий организм научился успешно справляться со многими вирусами.