Метилирование ДНК. Представление о метилировании чужеродных и лекарственных соединений.

Метилирование ДНК — это модификация молекулы ДНК без изменения самой нуклеотидной последовательности ДНК, что можно рассматривать как часть эпигенетическойсоставляющей генома. Метилирование ДНК заключается в присоединении метильной группы к цитозину в позиции С5 цитозинового кольца.

У человека за процесс метилирования ДНК отвечают три фермента, называемые ДНК-метилтрансферазами 1, 3a и 3b (DNMT1, DNMT3a, DNMT3b), соответственно. Предполагается, что DNMT3a и DNMT3b — это de novo метилтрансферазы, которые осуществляют формирование паттерна метилирования ДНК на ранних стадиях развития, а также его изменения в процессе дифференцировки клеток. Существует гипотеза о том, что метилирование ДНК de novo вызывается, в частности, интерферирующими РНК при помощи РНК-зависимого метилирования ДНК — процесса, возникшего в ходе эволюции с целью репрессии мобильных элементов генома. DNMT1 является ДНК-метилтрансферазой, которая поддерживает метилированное состояние ДНК, присоединяя метильные группы к одной из цепей ДНК в точках, где другая, комплементарная ей цепь, метилирована. Белок DNMT3L гомологичен другим DNMT-белкам, но не имеет каталитической активности. Вместо этого, DNMT3L поддерживает de novo метилтрансферазы, способствуя связыванию этих ферментов с ДНК и стимулируя их активность.

Метилирование. В организме метилированию могут подвергаться амины, фенолы и тиолы. В результате метилирования образуются соответствующие N-, О- и S-метильные конъюгаты. При метилировании чужеродных соединений и некоторых метаболитов переносчиком метильных групп является кофермент S-аденозилметионин. С участием метильных групп этого кофермента происходит метилирование перечисленных выше соединений. Реакции метилирования происходят под влиянием ферментных систем (метилтрансфераз).

Η-метилирование. При N-метилировании метильная группа S-аденозилметионина под влиянием N-метилтрансферазы присоединяется к атомам азота метаболитов или чужеродных соединений.

  О-Метилирование. Этому типу конъюгации подвергаются соединения, содержащие фенольные группы. Под влиянием ферментов (О-метилтрансфераз) метильная группа кофермента S-аденозилметионина присоединяется к атомам кислорода фенольных гидроксилов. Для реакции метилирования фенолов кроме кофермента требуется присутствие ионов магния или ионов других двухвалентных металлов. Соединения, содержащие одну фенольную группу, при наличии указанных ферментов не метилируются.

S- метилирование. Некоторые чужеродные соединения, содержащие тиоловые группы (-SH), в организме подвергаются метилированию. При этом метильная группа кофермента S-аденозилметионина в присутствии ферментов (метилтрансфераз) переносится к атомамсеры метаболитов или чужеродных соединений с образованием соответствующих S-метилпроизводных этих соединений.

112. Молекяулрные механизмы генетической изменчивости. Молекуляр­ные мутации: типы, частота, значение

Классификация мутаций

Изменения в геноме могут быть разнообразны и затрагивать различные по протяжённости участки ДНК от хромосом и генов до отдельных нуклеотидов. Наиболее драматичны геномные и хромосомные мутации, часто наблюдаемые на уровне соматических клеток. Если они имеют место в половых клетках, то для организма это имеет чаще всего летальные последствия. Частота мутаций в половых клетках высока. Существуют данные, указывающие на то, что в 20% случаев при беременности у эмбрионов наблюдают нарушения структуры хромосом. В 90% случаев это приводит к ненормальному развитию плода и элиминированию зародышей в результате спонтанных абортов. Выкидыши, происходящие в течение первых нескольких недель беременности, связаны с серьёзными нарушениями хромосом. В 50% случаев отмечается трисомия по аутосомам, т.е. вместо пары хромосом наблюдаются три. Пример такой патологии - болезнь Дауна, при которой хромосома 21 присутствует в 3 экземплярах. Некоторые генные мутации закрепляются в популяции, становятся наследственными и определяют эволюционные процессы. С мутациями такого типа связано появление различных наследственных патологий, сопровождающихся прекращением синтеза белка, кодируемого повреждённым геном, либо синтезом изменённого белка.

Генные, или точечные, мутации бывают в основном 3 видов:

· замены, при которых одно азотистое основание в ДНК замещается на другое;

· вставки, обеспечивающие внедрение в молекулу ДНК одного или нескольких дополнительных нуклеотидов;

· делеции (или выпадения) одного или нескольких нуклеотидов, при которых происходит укорочение молекулы ДНК.

Основные виды генных мутаций

Частота мутаций. Считается, что средняя частота возникновения мутаций в структурных локусах (областях локализации гена в хромосоме или в молекуле ДНК) человека колеблется в пределах от 10^-5 до 10^-6 на одну гамету за каждое поколение. Однако эта величина может значительно варьировать для разных генов (от 10^-4 для генов с высокой скоростью мутаций до 10^-11 для наиболее устойчивых участков генома). Столь существенные колебания в частоте возникновения мутаций обусловлены характером мутационного повреждения, механизмом возникновения мутации, протяжённостью кодирующей области мутантного гена, функциями белка, закодированного в этом гене. Так, для гена гемоглобина скорость замещения одного основания другим лежит в интервале μ = 2,5×10^-9-5×10^-9замен в гамете за одно поколение. Чтобы представить себе, что означают эти цифры, распространим эту скорость мутаций на весь геном человека - 3×10⁹ пар оснований. Умножив размер генома на скорость μ, мы получим, что геном за одно поколение может получить от 7 до 15 мутаций, т.е. это значит, что каждая гамета содержит такое количество изменений в ДНК по сравнению с родительской ДНК. А поскольку у каждого шадивидуума клетки диплоидны и получаются при слиянии 2 гамет, то мутаций тоже в 2 раза больше. Спрашивается, каким же образом человечество справляется с такой мутационной нагрузкой? Отвечая на этот вопрос, следует помнить, что кодирующие части генов, изменения в которых наиболее опасны, занимают не более 10% генома. Ситуация облегчается ещё и тем, что далеко не каждая мутация в кодирующей области имеет фенотипическое проявление. Многие попадают в 3'-положение кодонов и, таким образом, являются "молчащими", так как благодаря вырожденности генетического кода они не приводят к аминокислотным заменам, другие оказываются в доменах, несущественных для функционирования белков. Потомству передаются мутации, происходящие в гаметах, а их процент совсем невелик.

113. Генетическая гетерогенность. Полиморфизм белков в популяции че­ловека (варианты гемоглобина, гликозилтрансферазы, группоспецифических веществ и др).

Полиморфизм белков. Поскольку большинство нормальных клеток человека диплоидны, то они содержат две копии каждой хромосомы, одна из которых получена от отца, а вторая от матери. Эти две копии одной и той же хромосомы называют гомологичными. В ДНК каждой хромосомы содержится более тысячи генов. Соответствующие друг другу гены в гомологичных хромосомах называют аллелями. Аллели могут быть идентичными и содержат одинаковую последовательность нуклеотидов. В этом случае индивидуум, имеющий такие аллели, будет гомозиготен по данному признаку. Если аллели различаются по последовательности нуклеотидов в ДНК, то говорят о гетерозиготном наследовании гена. В этом случае индивидуум будет иметь 2 белковых продукта гена, различающихся по аминокислотной последовательности. У каждого человека существует только 2 разных аллеля одного гена, тогда как в популяции людей вариантов аллелей может быть огромное множество. Как уже говорилось ранее, изменчивость структуры ДНК, а следовательно разнообразие аллелей, обусловлено мутационным процессом и рекомбинациями в гомологичных хромосомах половых клеток. Если в ходе мейоза рекомбинации сопровождаются обменом участками ДНК, меньшими по размеру, чем ген, то такой процесс может приводить к появлению новых, прежде не существовавших аллелей. А поскольку рекомбинации - более частые события, чем мутации в кодирующих участках гена, то разнообразие вариантов аллелей обусловлено главным образом ими. Существование в популяции 2 и большего числа аллелей одного гена называют "аллеломорфизм", или "полиморфизм", а белковые продукты, образующиеся в ходе экспрессии этих вариантов гена - "полиморфы". Разные аллели встречаются в популяции с разной частотой. К полиморфам относят только те варианты, распространённость которьж в популяции не меньше 1%. В процессе эволюции отдельные гены амплифицируют с образованием копий, а их структура и положение могут изменяться в результате мутаций и перемещений не только внутри хромосомы, но и между хромосомами. Со временем это приводит к появлению новых генов, кодирующих белки, родственные исходному, но отличающиеся от него определёнными свойствами и занимающие в хромосомах разные генные локусы (или места). К родственным белкам относят изобелки, представляющие собой варианты белков, выполняющие одну и ту же функцию и обнаруживаемые в пределах одного вида организмов. Так, в группе из 2000 генов человека, кодирующих факторы транскрипции и транскрипционные активаторы, идентифицировано 900, относящихся к семейству белков, имеющих "цинковые пальцы". Существует 46 генов фермента глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, осуществляющего единственную окислительную реакцию в метаболическом пути катаболизма глюкозы до пирувата. Выявлены семейства родственных белков, возникшие в ходе эволюции из одного "предкового" гена, или гена-предшественника. Такие семейства составляют:

· гены миоглобина и протомеров гемоглобинов;

· группа протеолитических ферментов: трипсин, химотрипсин, эластаза, гшазмин, тромбин и некоторые другие белки и ферменты.

Группы крови. Другой важный пример полиморфизма белков, связанный с проблемой переливания крови, - существование в популяции людей 3 аллельных вариантов гена фермента гликозилтрансферазы (А, В и 0). Этот фермент принимает участие в синтезе олигосахарида, локализованного на наружной поверхности плазматической мембраны и определяющего антигенные свойства эритроцитов. Варианты фермента А и В имеют разную субстратную специфичность: вариант А катализирует присоединение к олигосахариду N-ацетилгалактозамина, а вариант В - галактозы. Вариант О кодирует белок, лишённый ферментативной активности. В результате структура олигосахаридов, расположенных на поверхности эритроцитов, будет разной. Антитела к антигенам А и В обычно имеются в сыворотке крови людей, на поверхности эритроцитов которых отсутствует соответшвующий антиген, т.е. индивидуумы с антигенами А на поверхности эритроцитов продуцируют в сыворотку крови антитела к В-антигенам (анти-В), а люди с В-антигенами ~ антитела к антигенам А (анти-А). В сыворотке крови анти-А и анти-В обычно присутствуют в высоких титрах и при появлении соответствующих антигенов способны активировать ферменты системы комплемента. При переливании крови руководствуются правилом, согласно которому кровь донора и реципиента не должна содержать антигены и антитела, реагирующие между собой: например, реципиенту, имеющему в сыворотке крови анти-А, нельзя переливать кровь от донора, содержащего на эритроцитах антигены А. При нарушении этого правила происходит реакция антиген-антитело. Это вызывает агглютинацию (склеивание) эритроцитов и их разрушение ферментами комплемента и фагоцитами. У индивидуумовгетерозигот, имеющих группу крови АВ (IV), на эритроцитах присутствуют А- и В-антигены, функционируют 2 варианта глйкозилтрансферазы (А и В), а следовательно антитела не образуются. Этих людей можно рассматривать как "универсальных" реципиентов, которым безопасно вводить эритроциты от доноров, имеющих любые группы крови. Однако люди с группой крови IV не могут безопасно получать сыворотку крови от этих доноров, так как она содержит антитела к А- и/или В-антигенам. В то же время индивидуумы, имеющие 0 (I) группу крови, - гомозиготы по неактивному варианту гликозилтранеферазы 0, и поверхность их эритроцитов лишена антигенов. Такие люди являются "универсальными" донорами эритроцитарной массы, так как их эритроциты можно вводить людям с группами крови А, В, 0 или АВ. В то же время сыворотка крови этих доноров содержит антитела к А- и В-антигенам и может использоваться только для пациентов 0 (I) группы крови.

Белки главного комплекса гистосовместимости и трансплантационная несовместимость. При формировании клеточного иммунного ответа узнавание Т-лимфоцитами чужеродного антигена происходит только если он расположен рядом с гликопротеинами, присутствующими на собственной клеточной мембране. Эти гликопротеины называют белками главного комплекса гистосовместимости, или МНС-белками. Существуют 2 класса этих белков: молекулы класса I и П. МНС-белки класса I обнаружены практически во всех содержащих ядро клетках, включая Т-киллеры, тогда как МНС-белки класса II найдены главным образом в клетках, участвующих в иммунном ответе, в антиген-представляющих В-клетках и Т-хелперах, но не в Т-киллерах и макрофагах. Строение МНС-белков кодирует семейство генов, расположенных на коротком плече хромосомы 6 и занимающих участок ДНК длиной более 6000 пар нуклеотидов. Это семейство состоит из серии тесно сцепленных генов, ответственных за синтез МНС-белков и некоторых компонентов системы комплемента. Гены комплекса отличаются чрезвычайно высоким полиморфизмом. Число разных аллелей достигает нескольких миллионов. Белки МНС-системы считают самой полиморфной системой человека. Вариабельность МНС-белков обеспечивает трансплантационную несовместимость. Клетки трансплантата имеют набор этих белков, отличный от МНС-белков реципиента (во всех случаях, кроме генетически идентичных близнецов), и это приводит к развитию реакции клеточного иммунитета, в результате которой трансплантированная ткань отторгается. Исследования показали, что полиморфизм различных белков настолько велик, что можно говорить о биохимической индивидуальности и уникальности каждого человека.