Профилактика внутрилабораторного инфицирования

 Во время выполнения лабораторных процедур с человеческими образцами и образцами клещей, которые могут содержать вирус ККГЛ, необходимо строгое соблюдение правил биобезопасности, обеспечиващий защиту для органов дыхания и глаз специалистами лаборатории до тех пор, пока образцы не будут инактивированы (например, во время аликвотирования или центрифугирования образцов, постановки ИФА с неинактивированными образцами, измельчения клещей для анализов).

Марлевые противочумные маски не обеспечивают должной защиты от аэрозолей, содержащих вирус ККГЛ, и не должны использоваться во время этих процедур.

 Должная респираторная защита может быть обеспечена при использовании электроприводного воздухоочистительного респиратора (далее –PAPR), оснащенного HEPA фильтром. Такими респираторами должны быть обеспечены все лаборатории, работающие c образцами, которые могут быть заражены вирусом ККГЛ.

 Все сотрудники, находящиеся в помещении во время проведения процедур, в процессе которых образуются аэрозоли, должны использовать PAPR.

Растирание/измельчение клещей или аликвотирование образцов должно осуществляться в шкафу биологической безопасности.

 Лаборанты, работающие с потенциально инфицированными образцами, должны использовать 2 пары перчаток и одноразовые лабораторные халаты.

 Перчатки и халаты необходимо снимать и утилизировать внутри помещения, где проводились работы.

Каждая рабочая станция должна быть оснащена легкодоступным пульверизатором с хлорсодержащим раствором.

После работы c потенциально инфицированным материалом шкаф биологической безопасности и рабочие поверхности должны тщательно промываться хлорсодержащим раствором, а затем – 70⁰ спиртом, чтобы избежать коррозии.

Для снижения риска инфицирования при растирании клещей рекомендуется использовать гомогенизатор тканей, который можно расположить внутри шкафа биологической безопасности (например MiniBeadBeater, BioSpec).

Для лабораторий, где нет водяной бани или нагревательного блока, необходимо приобрести один из таких приборов для инактивации образцов сыворотки до постановки ИФА.

Качество лабораторной диагностики играет важную роль как для ведения случая ККГЛ клиницистами, так и в эпидемиологическом надзоре за ККГЛ.

При молекулярных исследованиях (ПЦР-обратная транскрипция (далее – ПЦР-ОТ) в режиме реального времени) в каждой постановке должны использоваться внутренние контроли (положительный и отрицательный).

Для снижения риска заражения ПЦР, положительный контроль не должен выделяться вместе с другими образцами.

При подготовке реакции ПЦР соответствующий положительный РНК-контроль, который в результате реакции даст значение Ct – 29-35, должен разливаться после того, как будут разлиты все исследуемые клинические образцы.

Для повышения качества проводимых исследований рекомендуется использование более современных моделей оборудования для ПЦР (Rotor-Gene 6000 вместо Rotor-Gene 3000).

Для хранения праймеров, зондов, реагентов для ПЦР-ОТ, контролей- РНК и клинических образцов лаборатории должны оснащаться морозильными камерами, без функции саморазмораживания (Non-defrosting freezer).

Небольшие морозильные камеры внутри холодильников не подходят для хранения реагентов.

В идеале реагенты для ПЦР-ОТ должны храниться в отдельном морозильнике в «чистой комнате», где готовится реакционная смесь. Реагенты должны быть аликвотированы, a рабочие растворы должны храниться в отдельной коробке отдельно от остальных аликвот (чтобы избежать лишних циклов размораживания-замораживания аликвот с материалами, не используемыми в данный момент).

ПЦР является более чувствительным и более приоритетным тестом, чем ИФА на антиген для выявления вируса в крови и клещах.

 Если для определения вируса можно провести только одно исследование, предпочтение должно отдаваться ПЦР, а не ИФА Ag. ИФА Ag можно поставить в дополнение к ПЦР при тестировании человеческих образцов, взятых на ранней стадии заболевания (<5 дней c начала появления симптомов), но для образцов, взятых через 5-10 дней с начала появления симптомов, единственным достоверным тестом будет ПЦР, который и следует проводить.

Приложение 1
к Методическим рекомендациям
по совершенствованию диагностики
Конго-Крымской геморрагической
лихорадки среди населения
Республики Казахстан

Стандартные операционные процедуры по забору, хранению, транспортировке, биообразцов на Конго-Крымскую геморрагическую лихорадку.

Биообразцы: кровь, сыворотка.

 Лабораторные тесты: кровь, сыворотку исследуют в ПЦР, ИФА антиген, ИФА IgM и IgG.

Инструкция по забору биообразцов:

 Забор крови:

 Производится из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8-1,1 мм) в специальную вакуумную пробирку типа “Вакутайнер”:

с антикоагулянтом ЕДТА (сиреневая крышка);

цитратом натрия;

либо в пустую без добавления антикоагулянтов;

не берите кровь из той же руки, куда вводятся внутривенно препараты.

Наденьте халат, маску и защитные очки/защитный экран.

Наденьте 2 пары перчаток поверх рукавов халата длятого, чтобы обезопасить себя от попадания инфекционного материала на кожу.Края перчаток НЕ должны находиться под рукавом халата.

Перчатки НЕОБХОДИМО МЕНЯТЬ:

 от пациента к пациенту;

при заборе разных типов образцов от одного и того же больного (например, кровь и мазок);

 в случае, если какой-либо из образцов попал на поверхность перчаток (например, кровь).

 Усадите пациента.

Подготовьте все необходимые инструменты.

Наложите жгут выше локтя.

Найдите вену.

Обработайте место прокола марлевым тампоном, смоченным спиртом.

 Использованный тампон удалите в полиэтиленовый мешок для биологически опасных отходов.

Опустите руку в нижнее положение и совместите направление иглы c веной.

Твердо возьмите руку пациента и убедитесь в том, что кулак сжат.

 Натяните кожу с помощью большого пальца руки.

Острием, направленным вперед, введите иглу в вену.

Твердо, удерживая руку, наберите в шприц необходимое количество крови – 10 мл.

Ослабьте жгут.

Выньте иглу.

 Поместите ватный тампон, смоченный йодом на место прокола, и прижмите.

Налепите лейкопластырь на место прокола.

 Использованную иглу НИКОГДА не закрывайте крышкой. Поместите использованные острые предметы (иглы) в надлежащий контейнер для острых предметов.

Внесите кровь из шприца в вакуумную пробирку «Вакутайнер» с ЭДТА или цитратом натрия, или в пустую пробирку.

Пробирки c EDTA: необходимо смешивать для предотвращения свертывания крови. Сразу после забора плавно перемешайте, переворачивая пробирку 5 раз. СИЛЬНО НЕ ПЕРЕМЕШИВАТЬ. В не перемешанном виде содержимое пробирок с антикоагулянтами свернется, и будет необходимо брать образцы заново.

 Подпишите пробирку с кровью.

Пробирки поставьте в штатив!

Кровь должна быть доставлена в лабораторию в день забора в специальном, не протекающем контейнере c охлаждающими элементами или в термосе.

Сопроводительные документы к образцам должны быть помещены в полиэтиленовый пакет с застегивающейся молнией.

 Кровь. Если есть подозрение на вирусную геморрагическую лихорадку, работа с образцами должна проводиться только в, должным образом, оборудованных специализированных лабораториях.

Если выделение сыворотки на местах не возможно или не рекомендовано по причинам безопасности, образец крови должен быть доставлен в лабораторию, для проведения исследования, в сроки (от времени забора крови):

при t 22-24 ºС – не более 2-х часов

при t 4-8 ºС - не более 24 часов (не замораживать!)

Выделение сыворотки из цельной крови.

 Если образец крови не будет доставлен в лабораторию в течение 24 часов, сыворотка по возможности, должна быть выделена из крови перед отправкой образца. Процедура выделения сыворотки является опасной в виду возможности разбрызгивания содержимого пробирок и образования аэрозоля вследствие неисправности центрифуги при аварийных ситуациях. Поэтому лучше выделение производить в кабинетах биобезопасности или, при их отсутствии, использовать центрифугу и пробирки для образцов, обеспечивающие высокую степень герметичности.

Необходимые материалы и оборудование для забора сыворотки:

лабораторный халат, одноразовые перчатки, маска N95, очки или защитный экран;

одноразовые стерильные пипетки для переноса материала или стерильные пипетки Пастера и груша;

2 стерильные пробирки c закручивающимися крышками (8-10мл);

центрифуга в исправном состоянии с крышкой, с хорошо закрытыми пробирками и сбалансированная (рекомендуется использовать центрифугу c запаянным ротором или емкости для обеспечения безопасности внутри центрифуги);

маркер;

контейнер для острых предметов;

мешки для биологически опасных отходов;

если возможно шкаф биологической безопасности.

 Метод с использованием центрифуги:

перед центрифугированием дайте образцу крови свернуться. Спонтанное и полное свертывание обычно происходит в течение 30-60 минут при комнатной температуре (22-25 ºС);

центрифугируйте образец при (˜1000-2200 об/мин) в течение 10-15 минут. Стерильной пипеткой Пастера и грушей или мягкой одноразовой пластиковой пипеткой для переноса материала возьмите сыворотку из свернувшейся крови;

перенесите равное количество сыворотки в 2 стерильные пластиковые пробирки с закручивающимися крышками (примерно по 3 мл в каждую пробирку). Плотно затяните крышки (по мере возможности выполните эту работу в шкафе биобезопасности);

подпишите пробирки c образцом, указав данные о пациенте, которые указаны на оригинальной пробирке с образцом крови и на направлении;

хранить образцы сыворотки до отправки в лабораторию на исследование можно при 4-8 ºС не более 48 часов.

Метод без использования центрифуги:

если центрифуги нет, сыворотку можно аккуратно отделить от сгустков крови при помощи одноразовой пипетки для переноса материалов, но подождите 1-2 часа, чтобы обеспечить адекватную ретракцию крови в образец;

стерильной пипеткой для переноса материала отберите прозрачную желтую сыворотку, стараясь держать наконечник пипетки как можно дальше от сгустка и при этом, не разболтав кровь в пробирке во время забора сыворотки;

перенесите в 2 стерильные пластиковые пробирки c закручивающимися крышками, примерно по 3 мл сыворотки в каждую, и плотно затяните крышку;

подпишите пробирки, указав данные о пациенте, которые указаны на пробирке с образцом крови. Образцы сыворотки до отправки в лабораторию на исследование можно хранить при 4-8 ºС не более 48 часов.

Направление биообразцов в лабораторию.

 Каждый биообразец, отправленный в лабораторию, должен сопровождаться.

Рекомендации по транспортировке.

При транспортировке первичную герметично закрывающуюся тару c биообразцом помещают во вторичную тару (металлический или пластиковый пенал). Транспортировать биообразец следует в термосе с сухим льдом или термоконтейнере с хладоэлементом. Не подвергайте образцы сильной вибрации при транспортировке. Транспортировка биообразцов осуществляется специально выделенным транспортом в сопровождении обученного медицинского работника.

Критерии для отказа лаборатории в принятии образцов:

не подписанные образцы (без маркировки);

сломанные или протекающие контейнеры/пробирки;

образцы c недостаточной информацией о пациенте;

если информация о пациенте на образце и в форме-направлении не идентична гемолизированные биообразцы;

образец собран в неправильную пробирку/контейнер, например кровь для ПЦР не должна собираться в пробирки c раствором гепарина;

недостаточное количество образца для запрашиваемого теста;

 после продолжительного времени транспортировки или после неправильного обращения во время транспортировки (например сильные перепады температур неправильное хранение биообразцов).

Приложение 2
к Методическим рекомендациям
по совершенствованию диагностики
Конго-Крымской геморрагической
лихорадки среди населения
Республики Казахстан

Направление
на лабораторное исследование сыворотки/крови на ККГЛ

Наименование лечебной организации: __________________________________________

Номер истории болезни/амбулаторной карты:_____________________________________

Исследование крови/сыворотки (обведите): №1, №2, №3

Фамилия имя отчество пациента: _______________________________________________

Дата рождения: ______________________________________________________________

Домашний адрес: _____________________________________________________________

Место работы: ________________________­­­­­­­­­­­_______________________________________

Дата укуса/контакта с клещом, пребывания в эндемичном регионе, контакта с животными и др.___________________________________)______(указать дату и характер контакта)

Дата заболевания (дата повышения температуры):__________________________________

Наличие геморрагического синдрома: Да / Нет, Дата__________________________________

Наличие других клинических проявлений (Указать)________________________________

Диагноз/определение случая: ___________________________________________________

Дата забора крови _________________ время забора __________ч___________ мин

Дата начала лечения рибавирином: _____________________________ _______________

Дата последнего введения иммунной плазмы: ___________________________________

Время последнего введения иммунной плазмы: ____________ч________________ мин

Фамилия имя отчество лечащего врача: __________________________________________

Дата и время отправки крови/плазмы: ___________________________________________

Алгоритм обследования случая ККГЛ:

1-й образец (берется при поступлении): ПЦР и ИФА Ag и ИФА IgM1;

2-й образец (через 5 дней после 1-го): ПЦР и ИФА IgM2 и IgG1;

3-й образец (через 5 дней после 2-го): ИФА IgM3 + ИФА IgG2

­­­­Приложение 3
к Методическим рекомендациям
по совершенствованию диагностики
Конго-Крымской геморрагической
лихорадки среди населения
Республики Казахстан

   Анкета № для эпидемиологического расследования случая ККГЛ

Анкету заполнил(ФИО)______________________ Дата заполнения ___/_____________/ 20___г

  № истории болезни № экстренного извещения

.

.

.

.

Исследование сыворотки крови на ККГЛ
Забор крови № 1 произведен: да, нет, если «Да», то Дата забора ___/_____/20___г.
Тест: Проведение теста: Результат:

ИФА (Ag) да нет, если да то: положительный, отрицательный, сомнит.

ПЦР да нет, если да то: положительный, oтрицательный, сомнит.

ИФА(IgM) да нет, если да то: положительный, отрицательный, сомнит.

ИФА(IgG) да нет, если да то: положительный, oтрицательный, сомнит.

 Забор крови № 2 произведен: да, нет, если «Да», то Дата забора ___/_____/20___г.
Тест: Проведение теста: Результат:

ИФА (Ag) да нет, если да то: положительный, отрицательный, сомнит.

ПЦР да нет, если да то: положительный, oтрицательный, сомнит.

ИФА(IgM) да нет, если да то: положительный, отрицательный, сомнит.

ИФА(IgG) да нет, если да то: положительный, oтрицательный, сомнит.

 Забор крови № 3 произведен: да, нет, если «Да», то Дата забора ___/_____/20___г.
Тест: Проведение теста: Результат:

ИФА(IgM) да нет, если да то: положительный, отрицательный, сомнит.

ИФА(IgG) да нет, если да то: положительный, oтрицательный, сомнит.

 Исследование крови на другие патогены (риккетсии, бруцеллы и др.) проводилось:

да, нет, Дата забора ___/_____/20___г.

Название патогена _____________________________, тест__________, результат _______

Название патогена _____________________________, тест__________, результат _______

Название патогена _____________________________, тест__________, результат _______

Название патогена _____________________________, тест__________, результат _______

  Исследование клеща на ККГЛ проводилось да нет, если «Да», то