Этап 3. Удлинение побегов, индукция и развитие корней.

Побеги, полученные на этапе 2 при высокой концентрации цитокининов, могут иметь небольшой размер, что затрудняет манипуляции с ними. Удлинение побегов может быть достигнуто при их пересадке на среду, не содержащую цитокинины.

Пазушные или адвентивные побеги, полученные при наличии цитокининов, обычно не имеют корней. В связи с этим главная задача этапа 3 - индукция ризогенеза. Ризогенез имеет три фазы: индукция, инициация и элонгация. Первые две фазы трудно различимы. Образование корней происходит при низком содержании или отсутствии цитокининов и высоком содержании в среде ауксинов. Обычно остаточное количество цитокининов в побегах после этапа 2 достаточно, и их добавления в среду не требуется. На этапе 3 чаще всего применяют нафтилуксусную, индолилмасляную, индолилуксусную кислоты в концентрации 0.1 -1 мг/л.

Высокая концентрация солей подавляет развитие корневой системы. В этом случае концентрацию солей уменьшают в 2,- 4 раза. Обычно для укоренения in vitro в качестве носителя используется агар. Однако агар не является инертным материалом, содержит вещества, воздействующие на рост корней. Кроме того, твердая среда плохо аэрируется, из нее слабо удаляются продукты метаболизма. Существуют два основных способа преодоления этих недостатков: 1) добавление активированного угля, 2) использование жидкой питательной среды в сочетании с вермикультурой или применением полиуретановой пены.

Возможно и укоренение в нестерильных условиях. Так, например, микропобеги голубики высокой можно укоренять в смеси верхового торфа с перлитом 1:3 после обработки нижней части микропобега ростовой пудрой. Укоренение производится в условиях повышенной влажности и притенения, т.е. этап 3 сочетается с этапом 4. Корни образуются в течение месяца

Этап 4. Перенос в тепличные условия.

Микрорастения, выращенные в культуре in vitro, имеют ряд анатомических и физиологических особенностей. Для них характерны более мелкие и тонкие листья, слабо развитая кутикула, нарушение работы устьиц, ксилемные ткани в регенерантах могут образовать закрытую систему, поскольку побеги образуются до образования корней. Кроме того, тип питания микрорастений миксо- или гетеротрофный, но не автотрофный. Микрорастения при пересадке в условия теплицы для адаптации испытывают состояние стресса, что может приводить к гибели части растений от недостатка влаги, повышенной температуры и других неблагоприятных факторов среды. В связи с этим главная задача этого этапа - акклиматизация микрорастений в условиях in vivo. Кроме того, важно контролировать патогены, поскольку в условиях in vivo микрорастения могут инфицироваться бактериями, грибами, вирусами. В качестве дополнительной задачи этапа может быть укоренение, если корни недостаточно развивались на этапе 3.

Для успешного решения этих проблем микрорастения пересаживаются в теплицы или комнаты с контролируемыми условиями. Главные условия успешной акклиматизации растений in vivo: высокая относительная влажность, уменьшенная интенсивность света, не слишком влажный субстрат и оптимальная температура.

Обычно в теплице над пересаженными растениями устанавливаются укрытия из полиэтиленовой пленки для поддержания высокой влажности. Оптимальная влажность поддерживается с помощью туманообразующей установки, поскольку важен размер капель воды (чем меньше, тем лучше). Такие условия поддерживаются в течение 2-3 недель. Для предотвращения инфицированности микрорастений используют фунгициды и стерилизацию субстрата.

В качестве субстрата применяют верховой торф, а также его смеси с песком и/или перлитом. Хорошие результаты при укоренении микрорастений картофеля, сахарной свеклы показал субстрат на основе ионообменных смол «Биона», разработанный в Институте физико-органической химии НАН Беларуси.

Субстрат содержит необходимые элементы по прописи Мурасиге и Скуга. Важным его достоинством является возможность многократного использования

Микрорастения могут высаживаться непосредственно в грунт или стеллажи теплицы, в ящики, горшки или пластиковые кассеты. Кассеты удобны в транспортировке и обеспечивают растения при пересадке стартовым запасом субстрата, сохраняя при этом корневую систему.

Акклиматизация растений может начаться в культуре in vitro. Для этих целей открывают культуральные сосуды за несколько дней до высадки. Возможно также охлаждение дна сосудов.

Перспективным является изменение физиологического статуса растения in vitro в пассаже, предшествующем высадке. На кафедре с.-х. биотехнологии и экологии БГСХА отработана методика повышения приживаемости растений картофеля путем использования адаптогенов, добавляемых в среду при последнем пассировании. Применение янтарной кислоты в концентрации 0.05 - 0.5 мг/л, крезацина - (0.5 мг/л) и мивала (0.5 мг/л повышает приживаемость растений с 70 до 95-99%.

Растения в естественных условиях вступают во взаимодействия с почвенной микрофлорой. На корнях многих растений образуется микориза, ряд растений взаимодействуют в ризосфере со свободноживущими микроорганизмами. Микроорганизмы почвы улучшают азотное и фосфорное питание растений, снабжают корни регуляторами роста (ауксины, цитокинины), подавляют развитие патогенов. Поскольку микрорастения in vitro не вступают в контакт с микроорганизмами, целесообразно создавать такие микробоценозы в ризосфере на этапе адаптации,для чего особенно эффективны пластиковые кассеты. Источниками микроорганизмов могут быть специально культивируемые штаммы, а также природные ассоциации. В БГСХА в течение ряда лет изучалась возможность использования микрорганизмов в клональном размножении картофеля. Установлено, что добавление ризофила и азоспириллы в субстрат при выращивании рассады картофеля в кассетах обеспечивает повышение массы клубней с одного растения на 28-48%. Применение азоспириллы способствует снижению заболеваемости паршой на 16-23%.