Классификация методов клонального микроразмножения

Введение

Разработка методов культивирования in vitro различных видов растений создала предпосылки для применения принципиально новых подходов к их размножению. В настоящее время для ряда культур разработаны технологии клонального микроразмножения, т.е. способа вегетативного размножения растений на основе культуры in vitro. Такие технологии особенно актуальны для культур, размножаемых в производстве преимущественно вегетативно (картофель, плодовые, ягодные, декоративные, лесные растения).При длительном вегетативном размножении традиционными способами (черенки, луковицы, усы и т.д.) дочерние растения накапливают вирусную, бактериальную и грибную инфекцию, что снижает качество посадочного материала. Возникает необходимость в оздоровлении посадочного материала от инфекции. Перед клональным микроразмножением стоят следующие цели:

Ускоренное размножение уникальных генотипов в селекции растений;

Промышленное размножение посадочного материала высоких репродукций в семеноводстве растений;

Оздоровление посадочного материала от вирусной, бактериальной и грибной инфекции в процессе размножения;

Поддержание неконстантного материала, расщепляющегося в процессе семенного размножения (гибриды плодовых, ягодных, декоративных, и др. культур)

Размножение культур с длительным жизненным целом (древесные растения).

Размножение растений, которые невозможно или трудно размножить in vivo (стерильные формы для гетерозисной селекции).

Преимущества клонального микроразмножения в сравнении с традиционными методами заключаются в следующем:

Метод обеспечивает высокий коэффициент размножения, что дает возможность быстро внедрить в производство новые сорта растений. Метод не имеет альтернативы для видов,не размножаемых или трудноразмножаемых in vivо;

В процессе размножения обеспечивается оздоровление посадочного материала путем применения методов апикальных меристем, термотерапии или химиотерапии;

Небольшое количество стартового материала, возможность его сохранения в генбанках, в т.ч. in vitro;

Выполнение работ в лабораторных условиях независимо от условий внешней среды, экономия площадей, возможность регуляции средовых факторов;

Возможность автоматизации выращивания in vitro, применения промышленных технологий получения посадочного материала.

К недостаткам метода клонального микроразмножения следует отнести сложность и высокую цену применяемого оборудования, возможность повышения частоты мутаций в культуре in vitro, удорожание посадочного материала. В связи с этим клональное микроразмножение целесообразно применять для получения высоких репродукций в семеноводстве с последующим применением традиционных методов вегетативного размножения оздоровленного посадочного материала.

Методы оздоровления посадочного материала от вирусной, бактериальной и грибной инфекции

Оздоровление посадочного материала от вирусной, бактериальной и грибной инфекции выполняется на основе одного из трех методов (метод апикальных меристем, метод термотерапии, метод химиотерапии) или их сочетания. Получение свободных от вирусов растений (virus-free plants) является этапом и одной из целей клонального микроразмножения картофеля, плодовых, ягодных, декоративных, лесных растений.

Метод апикальных меристем

Меристема - конус активно делящихся клеток, расположенных на кончике побегов или корней. Для оздоровления используют меристему побегов шириной 0.1 мм и длиной 0.25-0.3 мм. Метод основан на том, что распределение вируса в растении неравномерно и наименьшая концентрация наблюдается в зоне апикальной меристемы. Вычленение апикальной меристемы и высадка ее на питательную среду приводит к снижению концентрации или полной элиминации вируса в дочернем растении после его регенерации из апикальной меристемы.

Существуют несколько теорий, объясняющих отсутствие вирусов в меристеме: медленное распределение вирусов в активно делящихся клетках, подавление размножения вирусов высокой концентрацией ауксинов, влияние компонентов питательной среды.

Авторами метода считаются Ж. Морель и С.Мартин (1952), впервые получившие свободное от вирусов растение георгинов от инфицированного донорного растения. В настоящее время метод получил широкое распространение и используется для оздоровления посадочного материала картофеля, плодовых, ягодных, декоративных растений. Использование метода апикальных меристем само по себе не гарантирует обязательного оздоровления. Вирус может присутствовать в апикальной меристеме в скрытом состоянии. В связи с этим необходимо сочетать метод апикальных меристем с другими методами оздоровления (термо- и химиотерапия) и применять для контроля вирусной инфекции в растении-регенеранте методы электронной микроскопии и/или иммуноферментного анализа. Отмечены случаи, когда свободные от вирусов регенеранты были получены от несущих вирусы апикальных меристем. Вероятно, потеря вирусов в этом случае связана с комбинацией факторов, возникающих при культивировании меристем (состав питательной среды, наличие гормонов и др.)

Какие факторы способствуют элиминации вирусов в культуре меристем? Одним из главных факторов является размер меристемы. Известно, что эффективность оздоровления обратно пропорциональна размеру меристемы, а эффективность регенерации растений из меристемы прямо пропорциональна. Поэтому для каждого растения подбирается оптимальный размер меристемы, обеспечивающий высокий уровень элиминации вирусов и приемлемый выход растений-регенерантов.

Верхушечные почки обеспечивают более высокую эффективность регенерации в сравнении с боковыми (эффект апикального доминирования). Влияние сезона и физиологического состояния растения на эффективность регенерации рассматривалось нами ранее. К примеру, для картофеля оптимален период после выхода клубня из состояния покоя. Эксплант (кончик побега), используемый для вычленения меристемы, стерилизуется в 75-95 % этаноле и /или 0.1 -.0.5 % гипохлорите натрия с последующим многократным промыванием в стерильной воде. Вычленение меристемы производится в ламинар-боксе в стерильных условиях под бинокулярным микроскопом. Размер вычленяемой меристемы 0.5 -+ 0.2 мм.

Для культивирования апикальных меристем используют обычно модификацию среды Мурасиге и Скуга, подбирая гормональный состав, оптимальный для культуры. Применяется невысокая концентрация регуляторов роста (0.1-0.5 мг/л); ауксины могут быть необходимы для образования корней, ауксины и цитокинины - для стимуляции клеточного деления, гибберелловая кислота иногда добавляется для удлинения побегов. Нормальной для культивирования меристем является температура 21-25 0 С, для луковичных растений требуется более низкая температура. Оптимальная длина дня - 14-16 часов.

Термотерапия

Тепловая обработка растений в культуре in vivo или in vitro обычно предшествует вычленению апикальных меристем. Термотерапия (лечение зараженных вирусными болезнями растений длительным воздействием на них повышенных температур) способствует элиминации вирусов в инфицированных растениях. Механизм этого процесса до конца не изучен. Предполагаются следующие возможные причины элиминации вирусов в результате тепловой обработки растений: инактивация имеющихся вирусов, увеличение темпа синтеза вирусных частиц с последующей деградацией, блокирование синтеза РНК вируса, уменьшение движения вируса к быстрорастущей апикальной меристеме. Различные вирусы по разному относятся к термотерапии. Так, например, вирусы картофеля располагаются в порядке увеличения трудности элиминации под действием термотерапии в следующем порядке: вирусы L, А, Y, F, М, Х, S, вироид веретеновидности клубней.

Термотерапия выполняется обычно при температуре, не угнетающей развитие растений и подавляющей развитие вирусов. Наиболее часто используется температура 36-38 0 С. Для выполнения термотерапии растения, черенки или клубни помещают в термокамеры, где в течение первой недели температуру увеличивают от 250 до 37 0 С путем ежедневного увеличения на 2 0 С. Освещенность 3,5-5тыс. люкс, фотопериод 14-16 часов в сутки, влажность 75-90 %. Термотерапию клубней картофеля выполняют в темноте в условиях термобокса, в результате получают этиолированные ростки.

Продолжительность термотерапии зависит от культуры, сорта и состава вирусов инфицированного растения. Если для картофеля оптимальная продолжительность составляет около 4 недель, то для хризантем - более 12 недель.

Для некоторых культур, угнетаемых под действием высокой температуры in vivo (розы, луковичные и др.) целесообразна термотерапия в культуре in vitro.

Эффективность термотерапии различна и зависит от особенностей культуры. Термотерапия особенно полезна для плодовых деревьев, где культура меристем затруднена. Для культуры картофеля метод недостаточно эффективен в связи с риском распространения вироида веретеновидности клубней. клональный микроразмножение клубневый репродукция

Химиотерапия

Метод предполагает использование химических соединений - ингибиторов вирусов, которые добавляются в состав питательной среды. Наиболее часто для этих целей применяют 1 в- Д- рибофуранозил -1,2,4 - триазол - 3 карбоксимид (коммерческое название виразол). Виразол стерилизуется путем фильтрации и добавляется в охлажденную среду. Концентрации препарата зависят от вида растений (1- 100 мг/л), длительность обработки подбирается эмпирически. По мере возрастания концентрации усиливается процесс элиминации вирусов, однако при концентрации выше 20-50 мг/ л уменьшается темп роста и может наблюдаться фитотоксический эффект. Виразол показал высокую эффективность при оздоровлении картофеля, черешни, сливы, малины, декоративных растений.

В Белорусском НИИ картофелеводства успешно испытан метод оздоровления посадочного материала картофеля на основе применения 2-5- олигоаденилатов - соединений, относящихся к классу олигонуклеотидов и являющихся посредниками противовирусного действия интерферона. Для 2-5- олигоаденилатов обнаружен большой спектр биологической активности, включая противовирусную, фитостимулирующую, цитокининоподобную и др.

Введение

Разработка методов культивирования in vitro различных видов растений создала предпосылки для применения принципиально новых подходов к их размножению. В настоящее время для ряда культур разработаны технологии клонального микроразмножения, т.е. способа вегетативного размножения растений на основе культуры in vitro. Такие технологии особенно актуальны для культур, размножаемых в производстве преимущественно вегетативно (картофель, плодовые, ягодные, декоративные, лесные растения).При длительном вегетативном размножении традиционными способами (черенки, луковицы, усы и т.д.) дочерние растения накапливают вирусную, бактериальную и грибную инфекцию, что снижает качество посадочного материала. Возникает необходимость в оздоровлении посадочного материала от инфекции. Перед клональным микроразмножением стоят следующие цели:

Ускоренное размножение уникальных генотипов в селекции растений;

Промышленное размножение посадочного материала высоких репродукций в семеноводстве растений;

Оздоровление посадочного материала от вирусной, бактериальной и грибной инфекции в процессе размножения;

Поддержание неконстантного материала, расщепляющегося в процессе семенного размножения (гибриды плодовых, ягодных, декоративных, и др. культур)

Размножение культур с длительным жизненным целом (древесные растения).

Размножение растений, которые невозможно или трудно размножить in vivo (стерильные формы для гетерозисной селекции).

Преимущества клонального микроразмножения в сравнении с традиционными методами заключаются в следующем:

Метод обеспечивает высокий коэффициент размножения, что дает возможность быстро внедрить в производство новые сорта растений. Метод не имеет альтернативы для видов,не размножаемых или трудноразмножаемых in vivо;

В процессе размножения обеспечивается оздоровление посадочного материала путем применения методов апикальных меристем, термотерапии или химиотерапии;

Небольшое количество стартового материала, возможность его сохранения в генбанках, в т.ч. in vitro;

Выполнение работ в лабораторных условиях независимо от условий внешней среды, экономия площадей, возможность регуляции средовых факторов;

Возможность автоматизации выращивания in vitro, применения промышленных технологий получения посадочного материала.

К недостаткам метода клонального микроразмножения следует отнести сложность и высокую цену применяемого оборудования, возможность повышения частоты мутаций в культуре in vitro, удорожание посадочного материала. В связи с этим клональное микроразмножение целесообразно применять для получения высоких репродукций в семеноводстве с последующим применением традиционных методов вегетативного размножения оздоровленного посадочного материала.

Классификация методов клонального микроразмножения

В основе клонального микроразмножения лежит явление тотипотентности, то есть способности растения структурно и функционально восстанавливаться из части, органа или отдельной клетки. Тотипотентность проявляется в клетках, называемых меристемоидами - морфогенетически компетентными клетками, которые отвечают на индукторы дифференцировки и состав сред образованием побегов, корней, зародыша. Их отличает крупное ядро, густая цитоплазма и небольшая вакуоль (Калинин, Кушнир, Сарнацкая,1992). Такие активно делящиеся клетки расположены в недифференцированной ткани верхушечных (апикальных) меристем, а также меристем пазушных и спящих почек стебля и т.п.

Образование меристематических тканей может быть индуцировано в культуре in vitro из специализированных тканей. В этом случае возникают добавочные меристематические ткани (процесс дедифференциации) в виде точек роста или соматических эмбриоидов. В дальнейшем происходит регенерация из меристематических тканей по пути органогенеза или соматического эмбриогенеза. Добавочные меристемы формируются непосредственно в родительской ткани, из промежуточного каллуса или клеток суспензионных культур.

Существующие методы клонального микроразмножения можно классифицировать в зависимости от типа меристематической ткани, используемой для регенерации, а также особенностей протекания процесса регенерации на три основных подхода:

Активация развития уже существующих в растениях меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля);

Индукция образования новых стеблевых почек или эмбриоидов непосредственно на тканях экспланта

Возникновение почек или эмбриоидов из первичного и пересадочного каллуса, суспензионной культуры клеток или протопластов.

Принципиальное отличие второго и третьего подходов от первого заключается в образовании новых меристематических зон среди специализированных клеток в результате процесса дедифференциации. Первый подход является наиболее естественным и предпочтительным, поскольку в нем участвуют уже сформировавшиеся меристемы, особенностью которых является генетическая стабильность. При использовании в качестве эксплантов дифференцированных тканей растений, образующих адвентивные почки или эмбриоиды, вероятность появления мутантных форм возрастает. Особенностью третьего подхода является образование почек или эмбриоидов через стадию каллуса, суспензионной культуры или протопластов, что еще более повышает возможность возникновения мутаций.

Активация развития уже существующих в растениях меристем является основным методом клонального микроразмножения. Метод основан на снятии эффекта апикального доминирования. При удалении верхушечной точки роста в пазушных почках возрастает концентрация цитокининов, снижается концентрация ауксинов, индуцируется клеточное деление и рост пазушных почек. Снять эффект апикального доминирования также можно путем добавления в питательную среду цитокининов (6- БАП, кинетин, 2 иП, зеатин). Под воздействием цитокининов происходит также реювенилизация, то есть омоложение тканей. Такие ткани обладают большей способностью к активному росту и регенерации побегов и корней.

Эксплантами для введения в культуру in vitro при этом методе служат апикальные меристемы или кончики побегов после их стерилизации. Апикальные меристемы используются с целью оздоровления посадочного материала от вирусной, бактериальной и грибной инфекции. Если проблема вирусов не является актуальной, целесообразно использовать кончики побегов. Следует иметь в виду, что чем больше размер экспланта, тем больше вероятность его успешной пролиферации в культуре in vitro. Однако при этом повышается и опасность инфицирования среды.

Р.Пиерик (1987) предлагает выделять метод однопочковых черенков (рис.1) и метод придаточных почек (рис2). Первый не требует применения цитокининов и успешно используется для культуры картофеля, томатов, огурцов и других культур. Второй основан на добавлении в состав среды цитокининов и применяется для размножения декоративных (гербера, гвоздика, розы и др.), плодовых (яблоня, груша, вишня, слива и др.), ягодных (земляника, смородина, малина, ежевика и др.), лесных (береза, тополь, туя, можжевельник и др.) растений.

Второй метод клонального микроразмножения - индукция образования новых стеблевых почек или эмбриоидов непосредственного на тканях экспланта. Он включает ряд процессов: дедифференциацию специализированных клеток, клеточное деление и образование новых меристем, образование и развитие органов. Процесс этот может происходить по пути органогенеза или соматического эмбриогенеза. Эксплант для прямого органогенеза или соматического эмбриогенеза может быть вычленен из многих органов растения (листа, стебля, зародыша, семядолей, чешуй и донца луковиц, корней, апикальных или пазушных меристем). По мнению Р.Пиерик, процесс образования адвентивных побегов лучше происходит в молодых частях растения (зародыши, проростки) или после реювенилизации тканей. Важную роль при этом играют углеводы, а гиббереллины и абсцизовая кислота его ингибируют. Процесс образования адвентивных побегов из тканей листа in vitro известен у 350 видов растений. Двудольные растения образуют почки на листьях чаще, чем однодольные.

Рис. 1. Схема клонального микроразмножения методом однопочковых черенков

Важным фактором является соотношение эндогенных регуляторов роста в экспланте и экзогенных - в питательной среде. Некоторые растения (например, цикорий) не требуют для образования адвентивных побегов ни ауксинов, ни цитокининов. Для большинства растений, образующих адвентивные побеги, необходимо наличие цитокининов, которому должно предшествовать наличие ауксинов. Как правило, для таких растений необходима высокая концентрация цитокининов и низкая - ауксинов (бегония, цветная капуста и др.). Для отдельных растений (лилия, гиацинт) достаточно наличия в среде только экзогенных ауксинов. В некоторых случаях возникают эмбриоиды. Такой путь характерен для моркови, льна, рапса. Образование адвентивных почек на сегментах листьев и чешуй чаще всего происходит из эпидермиса.

Адвентивные побеги получены при культивировании сегментов листьев, соцветий и цветочных почек таких двудольных растений как гербера, сенполия, бегония, маргаритка, каладиум и др; сегментов гипокотиля, семядолей, листьев - у представителей рода Вrassica (капуста кочанная, цветная, брюссельская, листовая, брокколи); из сегментов корней - у петунии. Достигнуты успехи в клональном микроразмножении однодольных растений на основе получения адвентивных почек у представителей семейств Liliaceae,Amaryllidaceae, Iridaceae (фрезия, гиппеаструм, амариллис, гиацинт, нарцисс, гладиолусы, лилии, тюльпаны и др.). Эксплантами в этом случае служили луковичные чешуи, сегменты донца луковицы, листья.

Рис. 2. Схема клонального микроразмножения методом придаточных почек.

Верхний ряд- розеточные растения, нижний ряд - удлиненные растения

Третий метод клонального микроразмножения - возникновение почек или эмбриоидов из первичного и пересадочного каллуса, суспензионной культуры клеток или протопластов. Главная его особенность в том, что меристематические ткани возникают в результате непрямого органогенеза или соматического эмбриогенеза. Этому предшествует дедифференциация специализированных соматических тканей экспланта, в качестве которого могут быть использованы практически любые органы растения (корни, стебли, листья, цветки и др.). Главная проблема, возникающая при клональном микроразмножении таким образом - возможные мутации (изменение уровня плоидности, хромосомные аберрации, генные мутации и др.) в культуре тканей, в связи с этим существуют два основных требования при использовании такой технологии.

Генетическая стабильность, т.е. полученный в результате размножения материал должен быть идентичен стартовому.

При повторном пассировании каллуса способность его к регенерации не должна быть потеряна.

Образование адвентивных побегов возможно при преобладании концентрации цитокининов над концентрацией ауксинов. Для успешного использования каллуса при клональном микроразмножении растений необходимы два важных условия: а) каллус должен содержать генетически стабильные меристематические ткани; б) каллус должен обеспечивать получение большого числа регенерантов. Имеются сведения о получении регенерантов из каллуса у хризантем, фрезии, томатов, лилий и других культур. Второй возможный путь регенерации из дедифференцированных клеток экспланта- соматический эмбриогенез. В этом случае среди клеток каллуса возникают индуцированные эмбриогенно детерминированные клетки. Они отличаются малым размером, плотным содержанием цитоплазмы, большим ядром и малым размером вакуоли. Пиерик (1987) обобщил сведения ряда авторов об условиях, необходимых для успешного соматического эмбриогенеза.

1. Высокая концентрация ауксинов для индукции образования эмбриогенных клеток. Для дальнейшего развития эмбриоидов концентрация ауксинов в среде должна быть уменьшена или они должны быть полностью исключены из состава среды;

2. Гиббереллин и этилен обычно ингибируют эмбриогенез;

3. Эмбриогенезу должна предшествовать ювенилизация тканей.;

4. Уменьшение содержания аммонийного азота в среде является важным фактором эмбриогенеза, наличие калия способствует эмбриогенезу, а высокая концентрация кальция ингибирует этот процесс. Образованию эмбриоидов способствует высокая концентрация солей в среде;

5.Обычно свет способствует эмбриогенезу, однако для некоторых видов этот процесс может протекать при слабой освещенности и в темноте.;

6.Высокая температура обычно благоприятна для соматического эмбриогенеза; некоторые растения (особенно в культуре пыльников) требуют холодового шока для образования эмбриоидов;

Оптимальная концентрация сахарозы 2-3 %.

Соматический эмбриогенез редко используется в практике микроклонального размножения в связи высокой вероятностью мутаций, трудностью метода, возможностью потери способности к регенерации при длительном пассировании каллуса. Его применяют для тех культур, где не отмечено повышение мутабильности (например, масличная пальма).

Возможно получение адвентивных побегов или эмбриоидов через стадию каллуса из одиночных клеток (суспензионная культура, культура протопластов).Получены положительные результаты в этом направлении у табака, моркови, спаржи и других культур. Проводятся исследования по разработке массового соматического эмбриогенеза с целью получения искусственных семян. Соматические эмбриоиды, в отличие от семян, полученных после оплодотворения из зиготы не имеют запаса питательных веществ. С этой целью эмбриоиды помещают в специальные полоски или капсулы с запасом питательных веществ. Возможен также посев искусственных семян в грунт с током жидкости. После разработки экономически оправданных технологий посева таким способом в перспективе можно будет размножать уникальные генотипы. Особую значимость такие технологии могут приобрести для размножения растений, не образующихся семян, а также растений, у которых половое размножение затруднено (стерильные формы при получении гетерозисных гибридов и др.).