Описание созданной системы и общего принципа действия.

Схема определения PАM последовательности для любого Cas-эффектора. Данная схема, основана на способности Cas-эффектора разрезать ДНК в строго определённой области. Эта область определена нуклеотидной последовательностью, которая комплиментарна sg-RNA с одной стороны и имеет PAM последовательность, к которой прикрепляется Cas белок с другой стороны. Для осуществления разрезания ДНК необходимо выполнять оба этих условия. Для создания предложенной нами схемы необходимо выбрать CRISPR кассеты, которые бы были комплиментарны разрезаемой ДНК. (Подбор CRISPR кассет проводится в базе данных анализа CRISPR кассет https://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/crispr/).

Зная нуклеотидную последовательность CRISPR кассет мы сможем создать систему Cas -эффекор - sg-RNA (в том числе Cas9-sgRNA). Для создания, упомянутой системы, необходимо обратиться в коммерческую фирму с заявкой, например Euro gene. Далее, мы подбираем праймеры для sg-RNA и так же заказываем их в коммерческих компаниях. Для проверки полученых результатов проведённой рестрикции с помощью Cas-Эффектор – sg-RNA необходимо заказать праймеры полученных фрагментов ДНК. Для этого находим на сайте ncbi геном организма или вируса, который будем разрезать. С помощью Cas – sgRNA устанавливаем место рестрикции гена. Потом в программе Fast PCR подбираем прямой и обратный праймеры для данного гена. И заказываем их в коммерческой фирме. После того как будут собраны все необходимые компоненты проводим реакции по определению PUM последовательности для Cas- эффектора. Результаты ПЦР будут отрицательными если в пробирке произошло разрезание ДНК, так как ген невозможно будет воспроизвести в полном объёме, а если результаты ПЦР положительные значит рестрикция не произошла.
Для определения PUM Последовательности Cas - эффектора используем CRISPR кассеты, которые нашли в базе данных для анализа CRISPR кассет, то есть мы получаем большую выборку. Образцы, в которых произошла рестрикция однозначно имеют PUM Последовательности для исследуемого Cas - эффектора. Поэтому, мы смотрим на участки гена, которые были подвержены рестрикции, от места прикрепления sgRNA по десять нуклеотидов слева и с права согласно методике (F.G.M. Mojica с со авторами, 2009) и выписываем в столбик. Повторяющиеся последовательности в 50% 10-нукдеотидных участках с большой долей вероятности будут PAM последовательности (Немудрый, 2014; Harrison et all, 2014).

Принцип работы CRISPR - Cas 9 системы.

У бактерии есть CRISPR кассета, которая состоит из повторяющихся участков, с которой считывается её РНК копия. Спираль ДНК раскручивается потом РНК по принципу комплементарности узнает этот участок и CRISPR-Cas9 система разрезает обе нити ДНК. Возникает дву-нитевой разрыв.
Чужеродная ДНК фага попадая в клетку бактерии подвергается нуклеазной рестрикции. После чего кусочки, полученные в результате этого процесса, встраиваются в CRISPR-кассету тем самым формируя новые спейсеры. Из этого, мы делаем вывод, что CRISPR-кассета у бактерий всегда растет. Данная бактерия после вышеупомянутого приобретает иммунитет к вирусу. С измененной CRISPR-кассеты начинается синтез РНК и идет процесс транскрипции. Молекула РНК начинает взаимодействовать с tracr-RNA и из них образуется sg-RNA, которая в свою очередь взаимодействует с белком Cas9. Образуется РНК Cas9 и в результате происходит трансляция cas9. Эта cas9 взаимодействует с sg-RNA и направляется к вирусу, разрезая его. Когда ДНК фага снова появляется в клетке ищут участок откуда этот кусочек был вырезан когда-то. Sg-RNA соединяется с Cas9, и это образование прикрепляется к комплементарному этой последовательности участку фага. С лева от этого участка не дальше 10 нуклеотидов должна быть PАM последовательность.

PАM последовательность – тот фрагмент ДНК, к которому прикрепляется Cas-белок и разрезает ДНК вируса, PAM последовательность – тот фрагмент ДНК, к которому прикрепляется Cas-белок и разрезает ДНК вируса (Гоглева, 2016; Шмаков, 2017).

2.2 Общая схема эксперимента с указанием основных этапов создания и тестирования системы

Схема 4.  Система позволяющая определить PAM последовательность для любого Cas-эффектора

Для Cas9 Streptococcus pyogenes не обходимо выбрать:

1 - Для проектирования вышеупомянутой схемы необходимо выбрать штам Streptococcus pyogenes и фаг. Мы выбрали штам St.Pyog M1 GAS и фаг 315.3.(ncbi).
2- Устанавливаем спейсеры каждой CRISPR кассеты выбранного нами штама.
3- Заказываем Сas9 белок и матрицу sg-RNA для каждого спейсера CRISPR кассеты и проводим синтез направляющей РНК.

4- Определяем праймеры на основных комплиментарных участков спейсеров в геноме фага. Праймеры подбираем таким образом, чтобы они могли воссоздать фрагмент генома фага, по среденине которго находится протоспейсер. Создаём праймеры в программе https://www.HYPERLINK "https://www.primer3.ut.ee/"primer3.ut.ee. Заказ праймеров и их ПЦР.
5 - Проводим рестркцию по схеме: в каждую пробирку добавляем ДНК фага Cas9 нуклеазу  и sgRNA соответствующую каждому спейсеру, таким образом, что бы sgRNA не пересекались (рис. 5) т.к. по условиям задачи система должна быть без клеточной и мы не трансформируем sgRNA в клетку, а вводим её в пробирку вместе с Cas 9 где содержится геном фага.

Рис 5. Схема добавления комплексов Cas9 sg-RNA.

Где: 1-4 – пробирки содержащие ДНК исследуемого фага + нуклеаза Cas9 + sgRNA соответствующих спейсеров; 5 пробирка содержащая ДНК исследуемого фага + нуклеаза Cas9; 6 пробирка содержит только ДНК фага.

6- Проверка рестрикции с помощью ПЦР
7- Определение PAM путём сопоставления результатов in sylico и in vitro.