Выявление почвенных микроорганизмов, вызывающих маслянокислое брожение

 Для выделения маслянокислых микроорганизмов используют среду Виноградского следующего состава (г/л): H₂O (дист.) – 1,0 л; глюкоза – 20; K₂HPO₄ – 1,0; MgSO₄x7H₂O – 0,5; NaCl - следы; CaCO₃ – 40; крахмал. Среду стерилизуют при 100 °С при 0,5 атм в течение 20 минут. В питательную среду вносят 1 г почвы. Пробирки помещают на водяную баню при температуре 80 °С на 10-15 мин. Затем пробирки закрывают пробками и ставят в термостат с температурой 30-35 °С. В таких условиях через 2-3 дня обнаруживают бактерии маслянокислого брожения.

Изучение возбудителей маслянокислого брожения методом брожения пектиновых веществ. Снопик льняной соломы высотой 6-7 см перевязывают в двух местах ниткой и вносят в пробирку лучше большего, чем стандартный, размера, наполненную на 2/3 водопроводной водой. Пробирку зажимают пинцетом и кипятят на горелке 2-3 мин. для удаления экстрактивных (легкосбраживаемых) веществ, которые могут служить источником углерода для других маслянокислых бактерий. Вода приобретает желто-зеленый цвет. Ее сливают. Вновь наполняют пробирку водопроводной водой, кипятят несколько минут и сливают. Так поступают 5-6 раз. После последнего кипячения жидкость не сливают. Охлаждают пробирку под краном, и в снопик вводят свежую соломину, не подвергшуюся нагреванию. Пробирку со снопиком ставят в термостат при 30-35 °С. Через 2-3 дня в ней начинается брожение, а через 5-8 сут. оно заканчивается. Накопление в культуральной жидкости масляной кислоты наряду с уксусной, образующейся при сбраживании продуктов гидролиза пектина, можно обнаружить при помощи качественных реакций на масляную кислоту.

Качественные реакции на масляную кислоту

Реакция образования масляно-этилового эфира. К 5 мл культуральной жидкости, полученной в результате выращивания маслянокислых бактерий, пибавляют 0,5 мл 96 %-ного спирта и 1-2 мл крепкой серной кислоты. Смесь хорошо взбалтывают и нагревают. Образующийся масляно-этиловый эфир определяют по характерному запаху, напоминающему запах ананаса.

Реакция с хлорным железом. К 5 мл исследуемой жидкости, содержащей соли масляной кислоты, добавляют 2 мл 5 %-ного раствора хлорного железа. Пробирку встряхивают и нагревают. Вследствие образования маслянокислого железа жидкость в пробирке приобретает коричневое окрашивание.

Для изучения морфологии возбудителей маслянокислого броженияснопик извлекают из пробирки, из его середины отбирают несколько соломинок и выжимают из них немного жидкости на предметное стекло. Добавляют каплю раствора Люголя, накрывают покровным стеклом и микроскопируют с иммерсионной системой.

Аэробное разложение целлюлозы. Использовалась среда Гетчинсона (г/дм3 дистиллированной воды): KH₂SO₄ - 0,1; NаСl - 0,1; СаСl₂ - 0,1; FеСl₃ - 0,1; МgSО₄·7Н₂О - 0,3; NаNО₃ - 2,5. Среду наливают в колбочки или пробирки, куда в качестве источника углерода помещают фильтровальную бумагу. В колбочки опускают складчатый бумажный фильтр, в пробирки - полоски фильтровальной бумаги. После стерилизации колбочки и пробирки засевают комочками почвы.

Анаэробное разложение целлюлозы. Для обнаружения в почве возбудителей анаэробного разложения клетчатки можно использовать питательную среду Омелянского. Среду стерилизуют в автоклаве при 1 атм в течение 30 мин. Жидкие питательные среды разливают высоким слоем в высокие пробирки. Фильтровальную бумагу нарезают полосками и опускают на дно пробирки. Засевают комочками почвы и инкубируют в термостате при 30-35 °C для обнаружения мезофильных бактерий и при 60 °C - для поиска термофильных бактерий. Через 3-4 суток при 60 °C в пробирках начинается процесс разрушения клетчатки, жидкость пенится, выделяется газ. Полоски фильтровальной бумаги желтеют, ослизняются, постепенно превращаясь в аморфную массу. При 30-35 °C разрушение клетчатки происходит медленнее. По истечении указанного срока среду подвергают микроскопическому и химическому исследованию. Для микроскопического исследования готовят мазок, окрашивают его фуксином и исследуют. Возбудители анаэробного разложения клетчатки имеют вид слегка изогнутых длинных палочек с крупной спорой на конце. Химическое исследование проводят в целях обнаружения продуктов распада клетчатки - этилового спирта, масляной и уксусной кислот. Возбудителями анаэробного разложения клетчатки являются мезофильные и термофильные микроорганизмы, относящиеся в своем большинстве к роду Clostridium.

Количественный учет анаэробных целлюлозоразрушающих бактерий проводят методом предельных разведений. Готовят ряд последовательных 10кратных разведений почвенной суспензии. Посев производят в несколько параллельных пробирок, которые инкубируют в термостате; просматривают, материалы учета обрабатывают по таблице Мак-Креди.

Метод Виноградского

Для выявления автохтонной истинно почвенной группы микроорганизмов, минерализующих гумусовые вещества, по Виноградскому отмытые от следов хлора и прокипяченные гелевые пластины пропитывают минеральной средой без источников углерода и азота (г/200 мл дистиллированной воды): К₂НРО₄ - 1,0; МgSО₄·7Н₂О - 0,5; NаС1 - 0,5; FеSО₄·7Н₂О - 0,01; МnSO₄·4Н₂O - 0,01. В чашку вносят 3-5 мл минеральной среды, а в качестве единственного источника углерода и азота добавляют гумат кальция. Чашки Петри с гелевыми пластинами с гуматами и комочками почвы помещают во влажную камеру крышками вниз и выдерживают при 25-28 °С. Вокруг комочков почвы на гумате появляются специфичные бурые колонии в виде тонких бархатистых налетов розового и белого цвета - Bactoderma (В. alba, В. rosea).