Соматичне клонування при використанні ядер соматичних клітин дорослого організму.

Принципово вищим ступенем клонування є так зване "соматичне" клонування, коли донорами ядер є соматичні клітини дорослого організму. Якщо в перших двох типах клонування можна отримати копії ембріона і невідомо, які властивості будуть мати тварини з цих зародків, то в останньому - копіюється існуючий дорослий організм. Отримання генетичних копій тварин відкриває неймовірні перспективи як для науки, так і для виробництва, але й реалізація соматичного клонування набагато складніша. Це викликано ступенем диференціації генетичного матеріалу клітин, що є донорами ядер для пересадок. Якщо на ранніх стадіях розвитку ембріону (2-4 клітини) всі бластомери є тотіпотентними і кожен з них може дати початок новому зародку, то на більш пізніх стадіях ембріогенезу це вже неможливо. Ядра 8-32 клітинних зародків вже диференційовані, але ступінь їх спеціалізації ще не висока і вони здатні активізуватися в цитоплазмі енуклейованої яйцеклітини, а створений ядерно-цитоплазматичний гібрид спроможний розвинутися в повноцінний зародок. Більш високий ступінь диференціації ембріональних стволових клітин, що отримують з внутрішньоклітинної маси бластоцисти, робить задачу реконструювання ембріону з їх ядер ще важчою. Набагато складніша задача активізувати ядра глибоко диференційованих соматичних клітин. Теоретично це можливо тільки в тому випадку, якщо соматична клітина буде на певній стадії мітозу - коли вона не виконує відповідні функції в організмі, а розмножується, тобто, певною мірою, схожа на ембріональну клітину. І хоча в 1997 році з'явилося перше повідомлення про клонування дорослої вівці, подібні публікації залишаються поки що винятковими. Отже, в теперішній час можна розглядати як науковий напрямок з певними досягненнями тільки клонування ембріональне. І хоча з загально біологічної точки зору соматичне і ембріональне клонування суттєво відрізняються, з точки зору використання цього методу в народному господарстві, зокрема в тваринництві чи фармацевтичній промисловості, різниця між ними може бути не великою. Це можливо за рахунок використання біотехнології, в якій комбінуються клонування як метод розмноження організмів і кріоконсервація як метод введення останніх в анабіоз. Запропонована біотехнологія дозволяє і у випадку використання ембріонального клонування передбачати ознаки нащадків за рахунок того, що, поки більшість ембріонів клону зберігається в замороженому вигляді - у рідкому азоті, 1-2 з них пересаджуються реципієнтам і перевіряються за якістю нащадків. Для повторного розмноження і отримання чисельних нащадків використовуються тільки ембріони тих клонів, що мають необхідні господарсько-корисні ознаки. За кількісними та якісними показниками ембріональне клонування наближається до соматичного саме при повторному (багаторазовому) розмноженні зародків, коли клоновані ембріони попереднього покоління є донорами ядер для наступного циклу реконструкції. У цьому випадку кількість зародків зростає в геометричній прогресії і ефективність реалізації біотехнології отримання нащадків з прогнозованими ознаками наближається до значень, що задовольняють практиків.

46.Методи попереднього відбору гамет за статтю.

Центрифугування і седиментація. Перша спроба регулювання статі за допомогою центрифугування була зроблена ще у 1925 році, але експеримент не дав позитивних результатів. У 1976 році було проведено центрифугування сперми кроля з використанням градієнту гущини у глюкозо-жовточно- цитратному середовищі з додаванням 12% лактози. Час центрифугування складав 15 хвилин, при 1000 об/хв при температурі 20 оС. В результаті осіменіння кролиць спермою з верхній фракції було отримано 58,6% самців, а з нижній фракції – 40,1% . Повторне центрифугування сперми не привело до розширення зрушення у відношенні статі у нащадків.

Виходячи з припущення, що спермії з Х-хромосомою на підставі їх високої маси, будуть швидше осаджуватися, ніж спермії з Y-хромосомою, був використаний метод седиментації. Осіменіння кролиць спермою з верхньої фракції привело до народження високої долі самців (27:7), а з нижньої фракції – самок (27:11). Однак спермії бугая цим методом поділити не вдалося.

Проводилась седиментація сперми бугая за допомогою градієнту щільності у середовищі, що складалося з знежиреного молока і яєчного жовтку. Процес розподілу сперміїв закінчувався через 1-3 години. Запліднення спермою з нижніх фракцій викликало народження 70% телиць, а з верхньої фракції – 63,9%. Однак середовище з знежиреного молока і яєчного жовтку не вдалося чітко стандартизувати, тому метод виявився ненадійним і не знайшов використання у практиці.

Суперечливість результатів експериментів по регулюванню співвідношення статі у нащадків, заснованих на розподілі сперміїв за їх масою, пояснюється тім, що маса сперміїв, характеризується значною варіабельністю і не має достатнього вірогідного зв’язку з Х- і Y-хромосомами. В більшості випадків спермії з Y-хромосомою були легше за спермії з Х-хромосомою всього на 2-4%.

Електрофорез. Вперше припущення про різну поведінку сперміїв у магнітному полі зробив біолог М.К Кольцов у 1930 році. Було встановлено, що спермії кролів з Х-хромосомами в процесі електрофорезу спрямовуються до аноду, спермії з Y-хромосомою – до катоду. У 60-х роках ця гіпотеза була підтверджена отриманням надлишку самок у нащадків кролів після штучного осіменіння „анодними” сперміями і самців після штучного осіменіння „катодними” сперміями. Однак, розподіл сперми бугая на фракції за допомогою електрофорезу не дав позитивного результату і різниця між нащадками різних статей, отриманих при заплідненні корів різними фракціями сперми, виявилася статистично невірогідною.

Метод фільтрації. В основу методу покладена різна рухливість сперміїв з різними статевими хромосомами. Так, більш легкі спермії з Y-хромосомою володіють більшою рухливістю і швидше проходять через в’язкій шар сироваткового альбуміну бугайців. Була використана вертикальна колонка з трьома шарами, причому концентрація альбуміну збільшувалася зверху у низ. За допомогою забарвлення сперміїв акрихіном було встановлено, що нижня фракція містить до 85% сперміїв із статевою Y-хромосомою. Біологічної перевірки методу на самках зроблено не було. Наступні перевірки цього методу дали суперечливі результати. Використання зазначеного методу у 1975 році дало можливість отримати 58,6% бугаїв з 158 телят, що народилися від штучно запліднених сперміями з Y-хромосомами корів.    

Використання лазера. Встановлено, що спермії з Х-хромосомами містять більше ДНК, ніж спермії з Y-хромосомами, ця різниця для сперми кнурів складає 3,4%, бугаїв – 3,8%, баранів – 4,2%,  а позитивні або негативні заряди клітин залежать від кількості ДНК. При використанні лазера спермії спочатку проходили флуоресцентну обробку, після чого їх пропускали через лазерний луч і під впливом негативно і позитивно заряджених пластин вони відхилялися у відповідний бік (рис.18). Проведені успішні досліди по розподілу сперміїв кроля з Х- і Y-хромосомами.

Однак необхідно відмітити, що описані методи розділення сперміїв доки ще недосконалі і їх неможливо рекомендувати для поширеного використання у практиці.  

З розвитком методів трансплантації і клонувания ембріонів все більшого значення набуває попередній відбір ембріонів за статтю і особливостями каріотипу. Впровадження методу визначення статі ембріонів перед їх трансплантацією дозволить цілеспрямовано одержувати бугаїв-трансплантантів для племпідприємств, успішніше вирішувати ряд інших

практичних питань у тваринництві. Наприклад, для розширеного відтворення стада й у товарних господарствах, що спеціалізуються по виробництву молока, бажано одержувати теличок, а в товарних господарствах, що спеціалізуються по виробництву яловичини — бугайців. Впровадження методів ідентифікації статі в доімплантаційних ембріонів дозволить уникнути одержання безплідних теличок-фримартинів при трансплантації реципієнтові двох ембріонів.             

 З цією метою використовують методи визначення каріотипу зародка (наявність X і Y хромосом) або імуногенетичне визначення наявності спеціальних Н—У антигенів, які містяться в зародках чоловічої статі.

Генетиками було встановлено, що стать детермінують не статеві хромосоми, як структурні спадкові одиниці, а локуси і локалізовані в них гени. Так функція детермінації сіменників належить локусу Y-хромосоми, в якому міститься Н- Y-ген. Як тільки диференціювання гонад у ембріоні відбулося, функція цього андроспецифічного гена та його продукту Н-Y-антигена практично здійснена і ген переходить в інактивований стан.

Перши ознаки диференціації статі у ссавців виявляються в ембріогенезі дуже рано. Такою ознакою є статевий хроматин, або тільце Барра. Статевий хроматин можна виявити в інтерфазних ядрах клітин, в яких тільце Барра міститься у вигляді забарвленого дисковидного тільця. Тільце Барра, як правило, (60-70%) міститься в ядрах клітин тварин жіночої статі. Його нема або небагато, лише в окремих ядрах (5-10%), у тварин чоловічої статі. Тому тільце Барра має назву жіночій статевий хроматин.

Необхідно відмітити, що у всіх видів ссавців утворення статевого хроматину суттєво випереджає диференціювання гонад. Тому статевий хроматин може бути раннім маркером статі, хоча він не має відношення до детермінації і диференціації статі.

Другою ознакою статі, яка рано з’являється в ембріогенезі, є Н-Y-антиген, здатний викликати в організмі імунну реакцію. Була встановлена унікальна консервативність цього гену. Оскільки диференціація сім’яників в ембріогенезі відбувається раніше, ніж диференціація яєчників, а саме процес диференціації здійснюється під впливом Н-Y-антигену, це визначає, що антиген спрямовує морфогенез сім’яників і визначає первинну стать. Якщо видалити Н-Y-антиген, гонадні клітини ХY починають морфогенез яєчників. Н-Y-антиген впливає і на статеві ознаки теличок із різностатевих двоїн. Якщо від корів отримують різностатевих двійнят, то в середньому 90% теличок залишаються стерильними. Це пояснюється тім, що Н-Y-антиген переміщується від близнюка-бугая по загальному кровоносному руслу, зв’язується з рецепторами клітин яєчника і тоді статева залоза у теличок складається в значній долі з сім’яникової тканини і в меншій – з оваріальної. Народжуються так звані телички-фримартини.

В наш час стать ембріонів великої рогатої худоби, які знаходяться на стадії доімплантаційного розвитку визначають за допомогою цитогенетичного і імунологічного методів.