Исследование противовоспалительных цитокинов и железосодержащих белков

 

Внебольничная пневмония относится к наиболее частым заболеваниям у человека и является одной из ведущих причин смерти, особенно у лиц пожило­го и старческого возраста. Сложность проблемы внебольничной пневмонии у лиц старших возрастных групп заключается в том, что в большинстве случаев заболевание ассоциируется с различной сопутствующей патологией, что ус­ложняет как диагностику, так и лечение таких больных.

Поэтому, поиск новых диагностических возможностей при внебольнич­ной пневмонии у лиц старших возрастных групп, несомненно, имеет большое практическое значение. Проанализированы ро­ли маркеров активности воспалительного процесса, некоторые провоспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухоли — а, интерлейкин - 1а, интерлейкин - 8. Интерес к цитокинам в последние годы чрезвычайно широк. В пульмонологической практике нарушения в цитокиновом звене обусловлены их ролью в регуляции иммунного и воспалительного ответа.

В ряде исследований показано, что внебольничная пневмония у пожилых пациентов часто развивается на фоне вторичных иммунодефицитных состояний. Это ухудшает прогноз для выздоровления и даже создает угрозу для самой жизни пациента [26]. При формировании иммунного ответа у больных внебольничной пневмонией субпопуляции Т - хелперов играют ключевую роль в регуляции функций иммуноцитов посредством продукции цитокинов, обладающих оппозиционными (про - и противовоспалительными) эффектами [85]. Нарушение продукции, секреции и рецепции цитокинов, имеющее место у пожилых пациентов, приводит к глубоким дефектам в антиинфекционной защите, вплоть до развития «иммунологического паралича», усугубляя прямое повреждающее действие патогенов и их токсинов на легочную ткань. Однако и до настоящего времени, работ, освещающих значение исследования таких провоспалительных цитокинов, как фактор некроза опухоли - а (ФНО-а), интерлейкин - 1а (ИЛ - 1а), интерлейкин - 8 (ИЛ - 8) при внебольничной пневмонии, у пожилых пациентов, крайне мало, а имеющееся в литературе сведения носят фрагментарный характер [10].

Название «интерлейкин - 1» было впервые дано макрофагальному лимфоцитактивирующему фактору, выполнявшему, как тогда считалось, роль по­средника между различными типами лейкоцитов. Задолго до иденти­фикации химической структуры интерлейкина - 1 этот фактор был известен под названием эндогенного пирогенна [23].

Интерлейкин — 1а является индуцибельным белком, в продукции которо­го принимают участие до 90% моноцитов периферической крови человека и до 40 - 60% тканевых макрофагов [23].

Как правило, клетки организма не способны к спонтанному синтезу ин- терлейкина - 1а, а отвечают его продукцией на инфекцию, действие микробных токсинов, воспалительных агентов, других цитокинов, активированных компо­нентов комплемента или системы свертывания крови.

Крупные повреждения тканей, либо генерализация воспаления, способст­вуют появлению интерлейкина - 1а в крови, его системному действию, связан­ному с активацией острофазового ответа на уровне организма и стимуляцией функций различных органов и систем, необходимых для обеспечения защитных реакций.

По данным литературы в плазме здоровых доноров не удается обнару­жить интерлейкин - 1а [19]. Но в нормальных условиях, суще­ствует четко функционирующая система секреции и ингибиции синтеза интерлейкина - 1а, поддерживающая тканевой гомеостаз. Любой же патологический процесс ведет к дисбалансу тонких механизмов регуляции цитокинов, когда начинает выявляться повышенная или пониженная продукция интерлейкина - 1а [19].

Интерлейкин — 8 является первым цитокином семейства хемокинов, опи­сан в 1988 году [4].

Термин «хемокины» был принят в 1992 году и представляет аббревиатуру двух слов «chemoattractant» и «cytokines». В зависимости от количества и рас­положения консервативных остатков цистеина различают 4 класса хемокинов: СХС (а-хемокины), СС ф-хемокины), С (у-хемокины), СХЗС (6-хемокины) [19].

На сегодняшний день интерлейкин - 8 считается основным и наиболее изученным представителем класса СХС. [19].

Основными продуцентами интерлейкина - 8 являются моноциты, макро­фаги, однако его могут продуцировать и другие клетки: нейтрофилы, Т - лим­фоциты, естественные киллеры и др. [19].

В качестве провоспалительного цитокина интерлейкин — 8 накапливается в воспалительных экссудатах: в синовиальной жидкости при ревматоидном арт­рите, в бронхоальвеолярных лаважах при легочном фиброзе. Повышенные кон­центрации интерлейкина - 8 обнаруживаются также в псориатических очагах поражения кожи наряду с интерлейкином - 1. При воспалениях суставов интерлейкин — 8 также опосредует инвазию нейтрофилов в синовиальную жидкость, его продуцируют активированные интерлейкином — 1 синовиальные клетки. Накопление нейтрофилов сильно выражено и при некоторых заболеваниях лег­ких: асбестоз, идиопатический фиброз легких, респираторный дистресс — син­дром взрослых, при которых эластаза и другие нейтральные протеазы нейтро­филов вызывают необратимые повреждения ткани легкого. Интерлейкин — 8 опосредует нейтрофильную инфильтрацию тканей, сопутствующую инфекци­ям, травмам, ишемии, инвазивному росту, при которых индуцируются первона­чальное накопление интерлейкина - 1 и фактора некроза опухоли - а [15].

Я.С. Гущина, JI.H. Касснер, Е.В. Маркелова изучали содержание интерлейкина - 8 в крови при острой пневмонии у детей. Авторы сделали соответствующие выво­ды, что чем активнее и тяжелее воспалительный процесс в легочной ткани, тем выше его уровень в крови. Тенденция к повышению этого цитокина наблю­дается и при присоединении атопического процесса, что подтверждает участие его в механизмах активации не только нейтрофилов, но и других иммунокомпетентных клеток [19].

Фактор некроза опухоли - а относится к наиболее активным цитокинам. Исследования этого цитокина имеют длительную историю, которая началась с наблюдений, сделанных в конце XIX века, об исчезновении или распаде опухо­лей инфекционных больных [19].

Стимулом для выработки фактора некроза опухоли - а в организме явля­ются бактерии, паразиты, грибы, вирусы, эндотоксин, энтеротоксин, а также некоторые цитокины. В то же время фактор некроза опухоли - а сам вызывает синтез интерлейкинов - 1, - 2, - 4,- 6 разными типами клеток. В настоящее время доказана его высокая плейотропность и мультифункциональность [10].

Фактор некроза опухоли - а является иммуномодулирующим и провоспалительным цитокином. Он принимает участие в формировании иммунного ответа почти на всех его этапах: на стадии представления антигена Т — хелперам, на стадии пролиферации Т - и В — лимфоцитов, на стадии контроля эффекторных функций лимфоцитов, т. е. продукции антител и дифференцировки цитотоксических клеток [10].

Этому цитокину отводится ведущая роль в патогенезе септицемии и сеп­тического шока, внутрисосудистого свертывания и полиорганной недостаточ­ности. Предполагают, что фактор некроза опухоли — а участвует в патогенезе многих аутоиммунных заболеваний. В связи с этим предпринимаются попытки лечения септического шока и некоторых аутоиммунных заболеваний методами, направленными на удаление фактора некроза опухоли - а из биологических жидкостей, на ингибицию его синтеза, или на блокирование рецепторов факто­ра некроза опухоли - а [10].

Следовательно, фактор некроза опухоли - а участвует в защите организ­ма от повреждающих агентов путем активации многих систем организма. Одни из них способствуют началу репаративных процессов в организме [10].

Л.В. Стельмах, Т.П. Сесь с соавтоваторами изучали уровни фактора некроза опухоли - а, ИЛ — 1р у больных раком легкого. Цитокины определяли в сыворотке крови иммуноферментным методом до и после химиотерапии. Выявили, что уровень ФНО — а составил 38,3±1,9 пг/мл и 13,8±0,9 пг/мл до и после лечения соответственно, уровень же ИЛ - 1р значительно превышал норму, как до, так и после лечения, и составил 200±15,3 пг/мл [10].

Трансферрин - это железосвязывающий гликопротеид и был открыт в 1947 году [10].

По данным Т.А. Салихова и A.A. Бугланова, трансферрин присутствует практически во всех физиологических секретах и жидкостях организма [10].

Наибольший интерес в клинике привлекают иммуномодулирующие и ростостимулирующие свойства трансферрина. Установлено, что происходит снижение трансферрина при тиреотоксикозе, первичном гипотиреозе, беремен­ности с анемией и повышение его при беременности без анемии и приеме эст­рогенов [10].

Функции трансферрина:

- переносит железо от места его всасывания (клетки слизистой оболочки тонкого кишечника) и от мест хранения (депо) в печени и селезенке к костному мозгу;

- переносит неиспользованное для синтеза гемма железо в депо;

- обезвреживает железо (вне связи с белком оно токсично для организма);

- участвует в митогенной пролиферации Т - лимфоцитов и, следователь­но, регулирует работу иммунной системы;

- участвует в противоопухолевом иммунитете;

- отражает иммунологигическую реактивность организма (относится к белкам острой фазы) [5]

 

Лактоферрин — железосодержащий гликопротеин с одной полипептидной цепью и с молекулярной массой около 80 ООО дальтон [9].

Лактоферрин впервые описали в 1939 году М. Спенсер и С. Спенсер.

По своей структуре он близок к трансферрину и может существовать в насыщенной и ненасыщенной железом (аполактоферрин) формах. Молекула лактоферрина состоит из N - 1 и С - долей [9].

Лактоферрин участвует в реакциях местной защиты ряда органов, вклю­чая легкие, в регуляции функций иммунокомпетентных клеток [9].

К настоящему времени накопилось достаточно сведений о связи сыворо­точного лактоферрина с нейтрофилами. Лактоферрин является маркером степе­ни зрелости нейтрофилов, а вторичные гранулы нейтрофилов являются секре­торными, как первичные. Благодаря этим гранулам осуществляется элиминация лактоферрина в экстрацеллюлярное пространство и повышение его уровня в плазме крови [20].

В целом, все исследователи отмечают повышение сывороточного лакто­феррина, по сравнению с установленной ими же «нормой», при различных вос­палительных и онкологических заболеваниях. При этом уровень лак­тоферрина в плазме являлся достаточно точным индикатором кинетики нейтрофилов. Однако при острых вирусных инфекциях чаще имела место гиполактоферринемия. Снижение числа нейтрофилов, уровней лактоферрина в крови при вирусных инфекциях объясняется известным фактом снижения толерант­ности к развитию при этих заболеваниях вторичного бактериального воспале­ния. При бактериальной же инфекции уровень сывороточного лактофер­рина, как правило, в 2 - 3 раза выше установленных «норм» и коррелирует в большей степени с содержанием С-реактивного белка, с показателями ингибиторов протеаз, не­жели с лейкоцитозом и скорости оседания эритроцитов [20].

Техника забора крови для определения цитокинов и белков производится следующим образом. Забор крови из локтевой вены в количестве 6 мл на 1 пробирку осуществлялся двукратно, на 2-й день пребывания в стационаре и перед вьшиской строго после 10 часового голодания пациентов. Биоматериал отбирают в стеклянные пробирки без стабилизаторов и через 1,5 часа подвергают центрифугированию при 3000 об/мин. в течение 20 мин. с целью отделения форменных элементов крови. Полученные образцы сыворотки отбирают в пластиковые ампулы эпендорфы в объеме 1 мл и замораживают при t= - 70°С. Хранят замороженными при температуре - 20°С до постановки иммунохимических реакций [20].

Содержание в сыворотке крови фактора некроза опухолей - а, интерлейкина — 1а, интерлейкина - 8 определяют с помощью тест-систем «РгоСоn», выпускаемые ООО «Протеиновый контур», г. Санкт-Петербург, методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Один тип антител иммобилизуется на внутренних поверхностях ячеек планшетов для микротипирования. Другой тип моноклональных антител к независимому эпитопу молекулы (ИЛ — 1а, ИЛ - 8, ФНО - а) находится в наборе в виде коньюгата с биотипом. Индикаторным компонентом является коньюгат пероксидазы хрена со стрептавидином, имеющим очень высокое родство к биотину. После инкубации и промывок в ячейки вносят коньюгат пероксидазы со стрептавидином, вновь инкубируют, промывают, вносят субстрат и с использованием автоматического фотометра для микропланшетов измеряют активность связанной пероксидазы [20].

Содержание железосодержащих белков в сыворотке крови определяют методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем «Вектор-Бест-Европа» п. Кольцово, Новосибирская область, согласно прилагаемых к ним инструкций [20].

Методика определения:

1. Перед использованием стрипов в лунки вносят по 200 мкл рабочего буферного раствора, выдерживают в течение 3 минут, раствор из лунок сливают, остатки жидкости тщательно удаляют;

2. В лунки 2-х рядов вносят по 100 мкл калибровочных проб и контрольной сыворотки, в остальные лунки по 100 мкл исследуемых образцов;

3. В течение 30 минут при температуре З7°С проводят инкубацию;

4. Лунки промывают 3 раза рабочим буферным раствором и дважды дистиллированной водой;

5. Во все лунки добавляют по 100 мкл раствора конъюгата и выдерживают в течение 30 минут при температуре 37°С.

6. Стрипы промывают.

7. Во все лунки добавили по 100 мкл раствора офенилендиамина, приготовленного непосредственно перед работой;

8. Смесь в течение 10-20 минут инкубировали;

9. Во все стрипы добавляли по 50 мкл стоп – реагента [20].

Регистрацию результатов проводят фотометрически на спектрофотометре для ИФА «Мультискан ЕХ», производство Финляндия, по длине волны 492 им. По результатам измерения вычисляют средние арифметические значения и строят калибровочный график (в координатах: ось абсцисс - концентрация лактоферрина и трансферрина в калибровочных пробах, ось ординат - соответствующее значение оптической плотности). Определяют концентрацию трансферрина и лактоферрина по калибровочному графику. Полученные значения умножают на коэффициент разведения соответствующих сывороток [20].

По некоторым исследованиям и данным из литературы следует, что существенное повышение концентрации факторы некроза опухоли - а в сыворотке крови при внебольничной пневмонии у лиц пожилого и старческого возраста, по сравнению с соматически здоровыми лицами пожилого возраста можно объяснить тем, что провоспалительный цитокин фактор некроза опухоли - а является одним из маркеров воспаления. Однако, его уровень в сыворотке крови при внебольничной пневмонии у пациентов молодого возраста значительно выше, чем у больных старших возрастных групп. Поэтому, такую низкую концентрацию ФНО - а при внебольничной пневмонии у лиц старших возрастных групп, по сравнению с молодыми пациентами можно объяснить тем, что воспалительный процесс в легких развивается на фоне уже имеющегося возрастного иммунодефицита [20].

Многие зарубежные и Российские ученые выдвигают гипотезы о том, что чем более выражена реакция иммунной системы, тем выше уровень цитокинов и наоборот [24].

Из всего вышесказанного можно сделать несколько выводов:

1. Для объективизации характера легочного воспаления у пожилых больных внебольничной пневмонией рекомендуется проводить сопоставление показателей состояния системы иммунитета, уровней содержания в сыворотке крови острофазовых железосодержащих белков - трансферрина и лактоферрина.

2. В клинико-лабораторную практику рекомендуется новый способ объективной оценки активности воспаления при затянувшейся внебольничной пневмонии у пожилых больных на основе показателей трансферрина и лактоферрина в сыворотке крови.

3. Пациентам пожилого возраста с внебольничной пневмонией в лечебных учреждениях рекомендуется определение фактора некроза опухоли — а, интерлейкина - 1а, интерлейкина - 8 в сыворотке крови для оценки выраженности воспалительного процесса и иммунного ответа.

4. Для оценки эффективности лечения больных пожилого возраста с внебольничной пневмонией рекомендуется, помимо общеклинических методов, использовать концентрации фактора некроза опухоли - а, интерлейкина - 1а, интерлейкина - 8 в сыворотке крови.