В поисках ольфакторных рецепторов

 

В те времена я был еще юн, неопытен (особенно в биологии, так как образование получил в неорганической химии) и совершенно лишен финансирования. Рисковать мне было нечем, а невежество не давало толком разглядеть, в какое абсурдное предприятие я намерен ввязаться. Если бы я только остановился на минутку и подумал о последствиях; если бы спросил авторитетного совета или провел более подробные предварительные исследования; если бы, наконец, был постарше и поопытнее, я бы наверняка не узнал тех волнительных и радостных мгновений, что выпали мне на долю в следующие 35 лет, – как не узнал бы и разочарований, провалов и неудач, верных спутников повседневной жизни ученого.

Короче, я пустился на поиск ольфакторных рецепторов. Первым делом нужно было найти многообещающий лиганд и использовать его в качестве наживки для белка. Выбирать такой химикат стоило среди самых сильных одорантов, основываясь на гипотезе, что интенсивный запах означает тесные отношения между лигандом и белком-рецептором.

Мой первый выбор пал на андростенон, стероид с запахом мочи, который мы уже неоднократно обсуждали. У этой молекулы исключительно низкий ольфакторный порог; к тому же она дает один из чистейших образцов избирательной аносмии – ее ощущает только половина народонаселения Земли, что само по себе требует для данного одоранта очень специфического рецептора. Андростенон – хорошо изученный половой феромон свиней; очевидно, для него должен быть свой рецептор у этого вида животных, и, скорее всего, не у него одного.

В общем, этот стероид выглядел как оптимальный выбор и обещал принести ожидаемые результаты.

В итоге карта и правда выиграла – но только гораздо позже, для Лесли Воссхолла, Хироаки Мацунами и их коллег, которые в 2007 году, ровно 30 лет спустя после первого сообщения о специфической аносмии к андростенону [4], сумели изолировать ольфакторный рецептор, сбой в котором и порождает этот обонятельный феномен [5].

В конце 1970-х андростенон, увы, оказался слишком крепким орешком для тогдашних аналитических инструментов и техник, что, впрочем, не помешало ему сыграть важную роль в событиях последующих лет, когда научные исследования и человеческие амбиции стали действующими лицами настоящего детектива с такими затейливыми сюжетными поворотами, что и во сне не приснятся.

Предполагалось, что количество рецепторов в ольфакторной слизистой даже таких крупных животных, как свинья или корова, ничтожно мало. Поэтому, дабы обеспечить нужный для эксперимента уровень чувствительности, ученые пользовались радиоактивно промаркированными лигандами. Таким способом они могли засечь количества искомого вещества в порядке до пикограмма (одной триллионной части грамма). Первым шагом должен был стать синтез прекурсора, который можно сделать радиоактивным в специальной лаборатории. Таким прекурсором стала сама молекула андростенона, которой можно придать двойную связь углерод-углерод и таким образом превратить в аналог, андростанон, очень близкий по структуре и запаху и помеченный двумя атомами радиоактивного водорода.

Вещество в продаже отсутствовало, и поэтому я решил синтезировать его сам через последовательность химических реакций, уже описанную в литературе. Все шло без сучка без задоринки, пока я не добрался до последней стадии – получения самого андростенона из лишенного запаха состава. Его получилось всего несколько миллиграммов, но и этого количества вполне хватило, чтобы наполнить все помещения в отделе отвратительной вонью. Тяжелый смрад застоялой мочи пропитал все лаборатории и дошел до рекреации, где мы с коллегами обычно собирались на кофе. Более того, он въелся в шерстяную ткань одежды, что неудивительно: андростенон намертво связывается с белками (а шерсть – это белок). Каждый сотрудник унес домой как минимум несколько молекул – достаточно даже для не самого тонкого обоняния, – что привело к целому ряду крайне неловких ситуаций. Гости, бывавшие у меня дома, наверняка решили, что регулярное мытье в привычки нашего семейства не входит.

После синтеза радиоактивной пробы из прекурсора лаборатория наконец смогла приступить к поискам… иголки в стоге сена. Стог представлял собой смесь сотен разных белков, выделенных из ткани, выстилающей назальные полости коровы и свиньи – их мы выбрали за большой размер и доступность биологического материала.

Работу мы начинали с визита на местную бойню рано поутру. Там мы вскрывали коровьи и свиные головы, забирали ольфакторные ткани, клали на лед и бегом бежали в лабораторию – экстрагировать белки. Получив экстракт, его инкубировали с малым количеством радиоактивного андростанона, давая пробе разойтись в растворе и связаться с любым подходящим белком (в надежде, что это окажется ольфакторный рецептор), который таким образом окажется радиоактивно промаркирован. Затем из смеси изолировали остатки лиганда и измеряли количество андростанона, связанного с белком. Этот этап старались пройти как можно быстрее, чтобы не дать лиганду отцепиться от белка.

Казалось бы, совершенно понятная процедура, если бы не тот факт, что искомого белка в сложнейшей смеси было ничтожно мало. Количество андростанона, неспецифически связавшегося с другими белками, в разы превышало количество специфически связанного с нашим гипотетическим рецептором. Суть в том, что андростанон – очень гидрофобная молекула, с 19 атомами углерода и единственным кислородом, который во всей структуре только и может взаимодействовать с водой. Андростанон и подобные ему соединения не любят оставаться в воде и охотно цепляются за что угодно, включая другие белки и даже стекло реторты. Где-то здесь мы начали подозревать, что андростанон, возможно, был далеко не лучшим выбором.

Эксперименты выдались долгие и трудные – в основном в холодном отсеке и с неизменно скудными результатами. Мы никак не могли получить внятные доказательства того, что специфичный андростенону белок вообще есть в экстракте. Пока мы сражались с материалом, стараясь добиться хотя бы приблизительно воспроизводимого выхода, в одном из ведущих журналов по биохимии появилась статья ровно с теми результатами, о которых мы мечтали, и полученными по тому же самому протоколу. У конкурентов все сработало превосходно, доказательства были недвусмысленны: да, существует специфичный белок, избирательно и воспроизводимо связывающий андростенон.

С одной стороны, это доказывало, что моя идея верна, но мысль о том, что я только что упустил свой золотой шанс, не слишком утешала. Было ясно, что я проглядел какие-то сугубо практические, но исключительно важные детали. В таких ситуациях вас накрывает не только разочарование от проигрыша как такового, но еще и ощущение собственной неадекватности. Многие в нашей профессии не умеют справляться с такими провалами; трудности подобного рода часто заставляют ученых бросать исследования. По-настоящему хороший специалист на самом деле умеет не только «делать хорошую науку»: еще он должен быть стойким, способным держать удар, падать и снова вставать – как боксер или игрок в покер.

В науке прийти к финишу вторым – значит не прийти вовсе. Вся слава достается тому, кто порвал грудью финишную ленточку. Но и это еще не все: часто она уходит не к тому, кто выдвинул новаторскую идею, и даже не к тому, кто получил доказательные результаты, – а к тому, кто их первым опубликовал. Сами понимаете, это далеко не всегда один и тот же человек. Гонка за публикациями подчас заставляет людей вести себя неэтично. Бывают случаи, хотя и нечасто, когда какой-нибудь ученый, узнав, что коллега отправил в журнал результаты, которые он сам пытался получить, начинает добиваться отсрочки чужой публикации в надежде тиснуть свою собственную первым, объехав конкурента на кривой козе.

Иногда давление столь велико, что статьи подаются (и местами принимаются) к публикации еще до того, как будет собран достаточно надежный пул доказательств, или с сильно отретушированными данными.

Да, я был сильно разочарован, но вместе с тем эта публикация странным образом укрепила меня в решимости продолжать двигаться выбранным курсом. Мы находились в самом начале; много чего еще предстояло сделать и выяснить. Доказательство того, что рецептор действительно существует, лишь закладывало основу для будущей работы: нам еще нужно было изолировать белок, понять его свойства, структуру и где именно в нее вписывается лиганд.

К тому же оставалась еще масса вопросов относительно физиологических аспектов такого рецептора. Как химический сигнал переводится в электрические импульсы? Как нейроны ольфакторной слизистой оболочки связаны с высшими областями мозга, отвечающими за восприятие и поведение?

Однако первым делом наша лаборатория должна была добиться ясных и точных результатов. В то время мы близко общались с коллегой по имени Кришна Персо – он работал в Уорикском университете (Англия), в лаборатории Джорджа Додда. Кришна тоже сходил с ума по этой теме, и мы вместе с ним решили сосредоточить усилия на поисках рецептора андростенона. Мы еще раз провели все те же эксперименты и получили прежние неубедительные результаты. Странным образом данные наших двух лабораторий во многом повторяли друг друга, а вот с той публикацией решительно расходились.

Потратив несколько месяцев на борьбу с андростеноном – неизменно с отрицательным результатом, – я решил бросить этот одорант и выбрать какой-нибудь другой, более гидрофильный.

Любопытно, что и по сей день те опубликованные данные никому не удалось повторить; судя по всему, принесшие их опыты были проведены некорректно.

 

Неожиданное открытие

 

Сидя на пепелище своего великого андростенонового провала, я принялся искать нового кандидата, который не обладал бы неудобной гидрофобностью этого стероида. Выбор пал на еще один мощный одорант, 2-изобутил-3-метоксипиразин, с его знаменитым запахом сладкого перца. Эта молекула обладает ароматом не менее (а возможно, и более) интенсивным, чем у андростенона, но при этом гораздо более гидрофильна. Это тоже маслянистое вещество, которое теоретически должно бы считаться нерастворимым. Однако по меньшей мере один грамм его можно растворить в литре воды – а это куда больше, чем требовалось для наших биохимических экспериментов. Как и с предыдущим нашим кандидатом, исключительно мощный запах этого пиразина предполагал, что у него должны быть совершенно особые отношения с ольфакторными рецепторами.

Я начал с самого начала и синтезировал пиразин, чтобы его можно было радиоактивно промаркировать. На сей раз лаборатория наполнилась свежим и куда более приятным ароматом – не чета затхлой вони андростенона. Но, сколь бы приятен и натурален ни был этот сладкий перец, им вскоре пропах весь отдел. Все, что попадало в холодильник, где хранился образец пиразина, скоро приобретало тот же узнаваемый аромат. Казалось, запах чудесным образом умножается, словно какой-нибудь вирус, и постоянно завоевывает новые территории. Простые вычисления, основанные на исключительно низком ольфакторном пороге этого дивного вещества, показывают, что одной-единственной капельки, всего в несколько миллиграммов, достаточно для ароматизации большого здания.

Но что касается экспериментов, с пиразином все оказалось решительно по-другому. Результаты явились мгновенно и были ясны и воспроизводимы. Уже через пару недель у меня накопилось достаточно данных, чтобы показать коллегам в Уорике, – я был очень горд собой. Впрочем, очень скоро стало понятно, что с ними все-таки что-то не так, – и я никак не мог сообразить, что именно. Слишком уж просто все выглядело. Все предвиденные трудности разрешились сами собой. Для верности я несколько раз повторил эксперимент: воспроизводимость была превосходна. Кривая насыщенности, низкий фон (основная трудность с андростеноном) и масса материала для работы. В этом-то и заключалась главная проблема: предполагаемого рецептора наблюдалось как-то уж слишком много.

Я наскоро подсчитал соотношение количества ольфакторных нейронов на квадратный сантиметр слизистой к общей площади реснитчатой мембраны. Даже если бы вся ее поверхность была сплошь покрыта белками-рецепторами, на каждый ольфакторный все равно приходилось бы в 10 000 раз меньше места, чем получалось по нашим данным.

Существовало только одно объяснение такому феномену, хотя принять его было и нелегко: наш белок на самом деле не был ольфакторным рецептором. Это мог оказаться любой белок, по случайному совпадению обладающий сродством с молекулой-датчиком. Это был настоящий эмоциональный шок. Я просто не мог допустить, чтобы холодные научные данные развеяли эйфорию предшествующих недель. Неужто мы и правда потратили столько времени на белок, не имеющий ни малейшего отношения к обонянию?

Несколько простых экспериментов по связыванию с экстрактами других тканей должны были показать, действительно ли искомая активность имела место только в носу. Это совершенно обычная процедура, когда хочешь соотнести биохимические данные с физиологией и понять, как работает тот или иной конкретный белок. Поэтому мы взяли для анализа ткани из печени, мозга, селезенки, легких и некоторых других органов. Все они показали отрицательный результат: мы смогли с уверенностью заключить, что способность связывать пиразин эксклюзивно принадлежала назальной ткани. Получалось, что бы мы там ни измеряли, оно явно имело отношение к обонянию. Значит, не все еще потеряно. Мы, по крайней мере, открыли что-то интересное, пусть даже и не соответствующее модели.

Мы решили проверить наш пока еще неизвестный белок еще раз. Когда идентифицируешь новый рецептор, одним из самых убедительных аргументов в его пользу будет то, что твой препарат in vitro распознает разные лиганды не менее эффективно, чем натуральный рецептор in vivo [6]. Физиологическими данными, подлежащими сравнению с биохимическими, в данном случае были ольфакторные свойства летучих молекул – описания запахов и обонятельные пороги. Самое время воспользоваться богатством научных знаний, накопленных за последние десятилетия.

В этой перспективе пиразин был очень удачным выбором: он и похожие на него соединения – важный класс пищевых одорантов, и занимающиеся ольфакцией ученые весьма пристально ими интересовались.

Мы взяли несколько соединений со сходной химической структурой, но разными ароматами. Пиразины и здесь не подвели: у них простые, относительно жесткие структуры, допускающие небольшие манипуляции с молекулами, – проверять их эффект на уровне запаха очень удобно. Этому были посвящены многочисленные исследования, обеспечившие достаточно данных и установившие прочную связь между структурой вещества и его запахом.

Изменения в длине углеводородной цепочки 2-алкил-3-метоксипиразинов в особенности радикально влияют на запах. Если производные с метиловой и этиловой группой пахнут орехами и жареным мясом, наличие последовательности из трех и более атомов углерода сразу придает соединению зеленый растительный (и гораздо более сильный) запах.

Сравнив между собой зеленые и ореховые пиразины, мы обнаружили, что эти два класса веществ ведут себя совершенно по-разному. Результаты экспериментов нас порядком взволновали – они оказались в точности такими, как мы надеялись: наш загадочный белок, чем бы он там на самом деле ни был, распознавал разные пиразины по запаху. Тогда мы решили сделать следующий шаг и проверить в рамках того же протокола другую серию веществ – алкил-замещенные тиазолы. У них производные с короткими цепочками (один или два атома углерода) тоже пахнут орехом и горелым, а прирост длины цепочки дает соединения с зеленым запахом. И снова эксперименты по связыванию полностью соответствовали ольфакторным данным.

Мы очень обрадовались таким результатам и отправили статью в Biochemical Journal. Ее приняли и опубликовали в январе 1982 года [6]. Но, несмотря на всю нашу радость, наличие белка в обонятельном органе не столько прояснило процесс восприятия запаха, сколько добавило в описание дальнейшей путаницы. Вот он, белок, специфически присутствующий в носу и способный распознавать летучие молекулы в соответствии с запахом, – но он не может быть одним из наших искомых рецепторов, потому что его слишком много.

Да, открытие неожиданное, очень интересное, но вместе с тем и разочаровывающее. Что ж, зато оно положило начало крайне волнующей истории, к концу которой мы еще даже не приблизились.

Само открытие, как это часто бывает в науке, произошло чисто случайно. Результаты научных исследований обычно далеки от ожидаемых и часто даже опровергают прогнозы, сделанные в самом начале проекта. Когда такое случается, первый импульс – выбросить все результаты и начать с новых посылок. Но вот по таким ситуациям как раз и видно хорошего ученого. Он не держится слепо за свою первоначальную идею, а критически оценивает результаты и нередко находит среди них что-то еще более неожиданное и захватывающее. В глыбе грязной породы подчас таится золотой самородок. История науки полна таких анекдотов.

Вспомнить хотя бы ионные жидкости [7], открытые или, вернее, признанные только в относительно недавнее время. С самого начала химической науки исследователи бились над особым классом веществ, которые упорно отказываются кристаллизоваться, и иногда в отчаянии бросали свои проекты на полпути. Ионные соединения называются солями – к ним принадлежит обычная столовая соль и вместе с ней многие другие минералы, дающие прозрачные, твердые кристаллы. Они состоят из двух частей: отрицательно заряженного аниона и положительно заряженного катиона, которые держатся вместе благодаря электростатическим взаимодействиям и организуются в строго упорядоченные структуры, которые мы и зовем кристаллами.

Это правило. Но из него бывают исключения – так называемые ионные жидкости. Когда структуры аниона и катиона достаточно сложны и не могут аккуратно составиться в простой паттерн, продукт не желает кристаллизоваться. Многим химикам-органикам знакомо это чувство безнадежности и даже отчаяния, когда новое соединение категорически не хочет становиться кристаллом – много таких упрямцев закончило жизнь в раковине. Сколько раз за всю историю науки экспериментаторы получали ионные кристаллы и не могли их узнать?

Большая удача, что мы не выкинули этот белок. В то время мы не сумели извлечь из открытия особой пользы, но, заинтригованные его непоследовательностью, решили продолжить исследования. Одоранто-связывающие белки, как их стали называть позднее, за последние три десятилетия принесли науке много ценнейшей информации, открыли новые перспективы и подняли ряд вопросов, относящихся к обонянию, – вопросов, на которые у нас до сих пор нет ответов.

 

 

8

Одоранто-связывающие белки