Использование генно-инженерных методов для получения и наработки человеческих антител.

В результате применения описанных выше методов получаются, в основном, нестабильно секретирующие продуценты человеческих антител. Наработка таких клонов в культуральной среде сильно затруднена из-за быстрой потери их активности. Решением проблемы является изготовление векторов, содержащих гены иммуноглобулинов или их фрагментов, и вставка их в геном бактерий, дрожжей, растений, насекомых или млекопитающих. Для этого из клеток, секретирующих монАТ, выделяют гены, кодирующие легкие и/или тяжелые цепи иммуноглобулинов или фрагменты цепей, или соответствующую матричную РНК (мРНК). Затем с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) получают необходимое количество копийной ДНК (кДНК), то есть амплифицируют (умножают) исходный генный материал. Теоретически для этого достаточно единственной клетки, но на практике берут популяцию клеток такого размера, которую удалось получить без потери активности. Полученную кДНК встраивают в плазмиды (кольцевые молекулы ДНК бактерий) или кольцевые бактериофаги и в таком виде вводят в бактериальные клетки для размножения (экспансии) полученных векторов. Готовые векторы можно хранить в холодильнике и использовать при необходимости наработать нужное количество соответствующих иммуноглобулинов или их фрагментов. Для такой наработки векторы вводят в клетки бактерий или эукариотов (иначе говоря, осуществляют экспрессию генов иммуноглобулинов).

4.1. Выбор генов, используемых для вставки в векторы.

Прежде чем приступить к изготовлению векторов, несущих иммуноглобулиновые гены, определяют, целые молекулы антител необходимо получить, или достаточно их фрагментов. Выбор в конечном итоге зависит от цели получения антител. Если антитела предполагается использовать в системах, требующих активности Fc-фрагмента, например, фиксация комплемента или антитело- зависимаяцитотоксичность, то необходимо клонировать и легкие и тяжелые цепи иммуноглобулинов, обеспечивая при этом правильноегликозилирование и правильную сборку цепей. Достигнуть этого можно лишь, используя клетки млекопитающих, чаще всего клетки миеломы, куда встраивают готовые векторы.

(Fab)2- фрагменты почти не уступают целым молекулам в способности связывать антиген, но не могут быть использованы в реакциях, требующих присутствия Fc-фрагмента. Эффективность (Fab)2- фрагментов для нейтрализации вирусов, опсонизации микробов ниже по сравнению с целыми молекулами, а также короче их время полужизни в организме. Наработка (Fab)2- фрагментов антител возможна тоже лишь в клетках млекопитающих.

Fab-фрагменты антител возможно нарабатывать (экспрессировать) не только в клетках млекопитающих, поскольку здесь не предполагается сборка цепей, но аффинность Fab-фрагментов и время полужизни значительно снижены по сравнению с целой молекулой антитела.

Наиболее доступна для экспрессии в бактериальных клетках вариабельная часть легкой цепи иммуноглобулина (Fv), но самостоятельное использование Fv-фрагмента сильно ограничено его функциональными возможностями. Чаще всего гены, кодирующие Fv-фрагмент мышиных антител, используют для конструкции векторов, в которых оставшаяся часть иммуноглобулиновых генов представлена генами человеческого происхождения. При экспрессии таких векторов в миеломных клетках получаются целые молекулы антител, Fv-фрагмент которых мышиного происхождения, а вся остальная часть- человеческого. Такие химерные монАТ не вызывают столь выраженного иммунного ответа на них при введении в человеческий организм, поэтому нашли свое применение в терапии. Исследования в этой области направлены на дальнейшую замену мышиной части антитела на человеческие вплоть до того, что лишь антиген- связывающий участок остается мышиным. Такие антитела называются «очеловеченными», но иммунный ответ на них в организме человека полностью исключить не удается.

4.2. Источники генного материала.

1) Получение кДНК.

Иммуноглобулиновые кДНК получают, например, таким образом: цитоплазму гибридомных клеток, содержащую мРНК с поли-А-концами инкубируют с твердым носителем, несущим поли-Т олигонуклеотиды, в присутствии обратной транскриптазы. Из популяции полученной таким образом кДНК выделяют молекулы, соответствующие по размеру кДНК легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов. (кДНКтяжелой цепи иммуноглобулинов составляет 2-3тыс. пар оснований в зависимости от изотипа антител). Полученные популяции кДНКидентифицируют при помощи генных проб J и С регионов антител.

В дальнейшем кДНК можно амплифицировать при помощи ПЦР. Для этого полученную популяцию кДНК последовательно нагревают и охлаждают в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, мономерных нуклеотидов и затравок- праймеров, представляющих собой искусственно синтезированные олигонуклеотиды, идентичные концевым последовательностям амплифицируемых молекул кДНК. При нагревании происходит денатурация и расхождение нитей молекулы ДНК, при последующем охлаждении часть нитей снова соединяется между собой, а часть- с комплементарными затравками- праймерами. Далее на одноцепочечных ДНК с праймерами при помощи ДНК- полимеразы происходит сборка комплементарных молекул ДНК. Таким образом количество копий ДНК увеличивается. Процесс можно продолжать, чередуя нагревание и охлаждение, пока концентрация молекул кДНК не достигнет желаемого уровня.

Копийная ДНК не нуждается в посттранскрипционной модификации, так как все интроны уже были вырезаны в процессе созревания мРНК. Для последующей экспрессии в бактериальных клетках это является преимуществом, так как прокариоты не имеют необходимых механизмов для правильного процессинга мРНК. Кроме того, кДНК имеет значительно меньшие размеры по сравнению с геномной ДНК, и поэтому ее проще выделять. Для экспрессии в клетках миеломы больше подходит геномная ДНК, содержащая, во-первых, эукариотическийпромотор, а, во-вторых, энхансер, локализованный на интроне перед VDJ-регионом. Этот энхансер (нуклеотидная последовательность, усиливающая транскрипцию гена) является тканеспецифичным, поэтому оказывается полезным лишь при экспрессии в миеломных клетках.

2) Получение геномной ДНК.

Существует много методов выделение геномной ДНК, рынок сейчас предлагает готовые наборы для получения ДНК требуемой чистоты и качества. Наиболее распространенный метод выделения ДНК включает в себя инактивацию нуклеаз при помощи SDS и протеиназы К, экстракцию фенолом и преципитацию этанолом или изопропанолом. Затем выделенную ДНК расщепляют нуклеазами, а полученные последовательности разделяют по размеру и идентифицируют подходящие по размеру популяции молекул ДНК на предмет содержания в нихиммуноглобулиновых генов методом Southern блоттинга с использованием генных проб из J региона. Выделенная геномная ДНК тоже может быть амплифицирована при помощи ПЦР, однако ее размеры, в несколько раз превышающие размеры соответствующей кДНК, усложняют эту процедуру.

4.3. Манипуляции с иммуноглобулиновыми генами.

1) Чаще всего целью генных манипуляций является замена константных областей мышиных или крысиных антител на человеческие для того, чтобы минимизировать иммунный ответ на используемые в терапии антитела. К настоящему времени открыто довольно многоэндонуклеаз и соответствующих им участков (сайтов) рестрикции на интронах иммуноглобулиновых генов, позволяющих разрезать гены в требуемых участках, затем отделять ненужные фрагменты (например, константные области мышиных иммуноглобулинов) и при помощи ДНК-лигаз сшивать с нужными фрагментами (человеческими константными областями).

2) Для придания антителу функциональной активности, присущей лишь определенным изотипам антител, можно поменять изотип на требуемый, заменив гены, кодирующие Fc-фрагмент на соответствующие желаемому изотипу.

3) Можно существенно изменить аффинитет антитела, произведя точечные мутации в участках ДНК, соответствующих антиген-связывающему центру. Для осуществления такой мутации ДНК переводят в одноцепочечную форму, встраивая ее в одноцепочечныйбактериофаг, например, М13. Затем этот бактериофаг инкубируют в присутствии ДНК-полимеразы с олигонуклеотидом, несущим мутацию икомплементарным (за исключением этой мутации) соответствующему участку ДНК. Мутантный олигонуклеотид достраивается при этом до размера целой ДНК и полученный гетеродуплекс вводят в клетку- хозяина (E.coli в случае М13). При размножении вируса внутри клетки получаются как исходные, так и мутантные копии ДНК, поэтому необходимы отбор и клонирование клеток с мутантным геном.

Точечную мутацию ДНК можно осуществить на стадии амплификации, используя измененные в нужной точке праймеры.

Первое время лишь методом проб и ошибок устанавливали, какую именно аминокислоту нужно заменить в антиген- связывающем центре для того, чтобы повысить аффинность антител. Теперь имеются широко доступные базы данных по трехмерным структурам многих белков и низкомолекулярных соединений. Определив первичную последовательность аминокислот в антиген- связывающем центре антитела, можно смоделировать пространственную структуру этого участка и сопоставить ее со структурой антигенной детерминанты. Специальные компьютерные программы позволяют при этом определить, какая замена аминокислот в антиген- связывающем центре могла бы обеспечить более тесный контакт с антигеном.

4.4. Конструирование векторов.

Векторы могут быть плазмидные или вирусные. В любом случае они должны содержать следующие компоненты:

а) все гены, необходимые для репликации вектора внутри клетки (бактериальной и/или эукариотической);

б) гены-маркеры (как правило, гены устойчивости к антибиотикам), позволяющие проводить селекцию клеток. Для наработки белка вэукариотических клетках необходима соответствующая система селективных генов, подобных, например, тем, которые используются при отборе гибридов миелома+лимфоцит по традиционной схеме получения монАТ.

в) ген, который предполагается экспрессировать (в данном случае кДНК или геномная ДНК легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов или их фрагментов).

Для сборки вышеперечисленных компонентов плазмиду или геном бактериофага разрезают рестриктазами на участке, не критичном для репликации плазмиды или жизненного цикла вируса. Далее конструкцию из необходимых генов соединяют с разрезанными концами при помощи ферментов ДНК-лигаз.

4.5. Введение вектора в бактериальную клетку (трансфекция).

Сконструированный вектор вводят в бактериальную клетку с целью получения большего количества векторных копий. Вектор вирусного происхождения имеет собственные механизмы проникновения в клетку- хозяина, плазмидные векторы нуждаются в дополнительном воздействии на клетку- реципиента. Таким воздействием может быть обработка клеток фосфатом или хлоридом кальция, либо приложение электрического тока. В любом случае лишь часть клеток оказывается трансформированной (несущей вектор). Отделение их из общей массы выполняют в процессе клонирования. Смысл и цели клонирования здесь те же, что и в предыдущей главе: из индивидуальных клеток выращивают клоны и отделяют среди них те, что несут в себе необходимый ген. Содержание этого гена определяют, например, при помощи гибридизации лизированного образца клона с радиоактивной пробой, полученной химическим синтезом.

Клоны, несущие необходимый ген (позитивные клоны) нарабатывают в агаре, выделяют векторные молекулы, которые затем вводят вэукариотические клетки с целью получения полноценных иммуноглобулинов.

4.6. Экспрессия генов иммуноглобулинов в бактериальных и эукариотических клетках.

Бактериальные клетки могут быть использованы только для наработки Fab или Fv- фрагментов антител, так как не имеют аппарата длягликозилирования и сборки иммуноглобулиновых молекул. Дрожжевые клетки могут секретировать целые молекулы антител, однако, с низким выходом и неправильным гликозилированием. Такие антитела не способны выполнять все присущие им функции, например, запускать систему комплемента.

Полноценные рекомбинантные человеческие антитела получаются в результате трансфекции миеломных клеток. Для этой цели можно использовать мышиную миелому sp2/0, а антитела нарабатывать в виде асцитов.

Имеются данные об экспрессии иммуноглобулиновых генов в клетках насекомых. Векторы для такой экспрессии изготавливают на основе бакуловирусов, а иммуноглобулиновые гены встраивают внутри гена polyhedron, не являющегося жизненно необходимым для вируса, но имеющего очень сильный промотор. Гены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов встраивают в противоположных направлениях по отношению друг к другу, поэтому каждый из них оказывается под контролем промотора polyhedron. В результате инфицированные насекомые производят иммуноглобулины в количестве 50-70% от всего синтезируемого ими белка. Есть данные, что, по крайней мере, часть синтезируемых насекомыми антител собираются и гликозилируются надлежащим образом.

Экспрессия иммуноглобулинов в растениях находится пока в стадии разработки. Для трансформации листьев табака использовали бактериальные векторы, в которые по отдельности встраивали гены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов. Растения, трансфицированныегенами тяжелых цепей, скрещивали с носителями легких цепей иммуноглобулинов для получения потомства, синтезирующего обе цепи. Были получены растения, продуцирующие обе цепи иммуноглобулинов в количестве 1,3% от суммарного белка листьев. Корректностьгликозилирования таких антител пока не ясна.

5. Использование фаговых библиотек (дисплеев) для производства монАТ.

В тех случаях, когда доступность иммунных В-лимфоцитов особенно ограничена (например, при получении человеческих монАТ к токсичным или низкоиммуногенным веществам), использование фаговых библиотек может быть наилучшим выходом в такой ситуации, так как не требует стадии иммунизации. Популяции В- лимфоцитов, выделенных из лимфоидных органов нескольких десятков неиммунизированныхлюдей, могут продуцировать антитела с очень большим спектром специфичностей. В таких популяциях присутствуют клетки- продуценты антител разной аффинности практически к любой возможной антигенной детерминанте, не являющейся аутоантигеном для всех людей, клетки которых были использованы для создания дисплея.

Полиаденилированную мРНК выделяют из В-лимфоцитов и при помощи ПЦР получают амплифицированную кДНК, кодирующую Fv-фрагменты легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов. Затем на ее основе изготавливают векторы и вставляют их в геном однонитчатых фагов. В итоге каждая фаговая частица должна содержать ДНК, кодирующую одноцепочечный Fv-фрагмент определенной специфичности. Далее следует трансфекция этими фагами бактериальных клеток, в результате чего получают популяцию бактерий, экспрессирующих фрагменты человеческих антител самой разнообразной направленности. Такая популяция называется фаговой библиотекой или фаговым дисплеем. Объемфаговой библиотеки определяется разнообразием специфичностей продуцируемых антител и превышает сегодня величину 10¹⁰. Соматические мутации внутри встроенных иммуноглобулиновых генов дают дополнительное разнообразие Fv-фрагментов антител.

Для того, чтобы фрагменты антител экспрессировались на внешней мембране бактериальных клеток, ген Fv-фрагмента соединяют с геном поверхностного белка. Бактерии, экспрессирующие фрагменты антител нужной специфичности, отбирают, пропуская всю библиотеку через микротрубочки с сорбированным антигеном. В итоге внутри таких трубочек остаются в основном клетки, на поверхности которых имеются фрагменты антител против этого антигена. Затем эти клетки клонируют, отбирают среди них продуценты с наилучшими характеристиками (в первую очередь, аффинность антител, а также уровень антителопродукции, стабильность и пр.).

Несмотря на то, что аффинность Fv-фрагментов в целом на порядок ниже, чем аффинность соответствующих целых молекул антител, при помощи фаговых дисплеев удалось получить довольно аффинные Fv-фрагменты с Кd, меньшей 10^-9М. Время, затрачиваемое на получение таких мини-антител, сократилось до двух недель.

К недостаткам метода можно отнести трудности в поддержании разнообразия библиотеки: изначально разные клоны в ней были представлены неодинаковым количеством копий, по мере культивирования библиотеки эта разница неизбежно увеличивается, и минорные специфичности довольно быстро утрачиваются. Другим моментом является высокая частота соматических мутаций, происходящих вне контроля человеческого организма. В результате таких мутаций полученные мини-антитела, хотя и являются изначально человеческими, приобретают иммуногенность, поэтому могут быть использованы в терапевтических целях с известной осторожностью.