Факторы, влияющие на осаждение ферментов

Процессы агрегирования белков и формирования осадков зависят от условий осаждения, природы осадителя и многих других факторов.

Размер молекулы белка.

При прочих равных условиях чем больше молекула, тем ниже критическая концентрация растворителя, при которой происходит осаждение фермента. Но на эту зависимость могут оказывать влияние степень гидрофобности молекул, устойчивость сольватного слоя и т.д. Однако как правило, крупные молекулы агрегируют быстрее, чем мелкие, так как в этом случае больше вероятность того, что на их поверхности находится заряженный участок,  комплиментарный другому белку.(рисунок 1.1)

Рисунок 1.1 Агрегирование белков в их водном растворе с органическим растворителем [2]

Наличие в растворе некоторых ионов.

Некоторые ионы могут оказывать стабилизирующее влияние на фермент. Ионы Ca²⁺ способствуют сохранению активности амилаз, протеиназ, глюкоамилаз; защитным действием обладают ионы магния, марганца, кобальта. Наличие электролитов часто позволяет снизить расход осадителя и улучшить структуру осадка. В то же время ряд ионов (Fe²⁺, Pb²⁺, Cu²⁺, Ag ⁺, Ni²⁺ и др) действуют отрицательно и их присутствие крайне нежелательно.[2]

Температура

Большинство ферментов при комнатной температуре легко денатурируются органическими растворителями, в особенности в присутствии заметных количеств ионов солей. Поэтому на всех этапах работу следует проводить в условиях значительного охлаждения при температурах, близких к точкам замерзания обрабатываемых смесей. Прибавлять растворитель начинают при 0˚С, а разделение (фракционирование) смеси ведут при -5˚, -6˚, до -10˚С и даже до -20˚С. Раствор не должен нагреваться от выделения тепла при смешивании растворителя с водой. Полученные фракции не должны нагреваться даже на несколько градусов, пока растворитель не будет удален, или пока его концентрация не станет безопасной при разбавлении.

Отмечено, что низкая температура предохраняет белки от денатурации и в то же время усиливает осаждающее действие (например, спирта), т. е. улучшает фракционирование. [3]

Повышение температуры в присутствии растворителя способствует изгибанию структуры фермента (рисунок 1.2) — стадия А. Небольшие молекулы органического растворителя проникают в поверхностные трещины, образующиеся спонтанно в результате естественной подвижности структуры, где гидрофобно связываются с внутриглобулярными остатками аминокислот (лейцин, изолейцин, валин, тирозин и др.) — стадия Б. Это неизбежно приводит к нарушению внутримолекулярных гидрофобных взаимодействий фермента (стадия В) и часто к изменению конформации активного центра и потере ферментом каталитической активности, т.е. проявляются все признаки денатурации. При температуре осаждения смеси свыше 10-15˚С наблюдаются все признаки инактивации ферментов, причем тем выше, чем чище осаждаемый фермент.

Рисунок 1.2 Денатурирующее действие органических растворителей и температуры [2]

рН среды

Очень большое значение при осаждении ферментов имеет рН среды. Из одного и того же ферментного раствора при различном значении рН можно получить различное количество осадка с неодинаковой активностью ферментов. Это связано с тем, что наиболее полно ферменты выпадают в изоэлектрической точке, когда создаются наиболее благоприятные условия для агрегирования белковых молекул. Процесс осаждения белков в изоэлектрической точке без применения осаждающих реагентов называется изоэлектрическим осаждением. Использование органических осадителей при рН, близком к изоэлектрической точке, позволяет ускорить осаждение ферментов и использовать растворители более низких концентраций. При отклонении величины рН от изоэлектрической точки выход осадка и особенно активность фермента падают до 30-50% от максимальной величины. Поэтому необходимо строго соблюдать режим поддержания оптимального значения рН в момент осаждения ферментов органическими растворителями.

Длительность контакта с растворителем

Следует стремиться сократить время контакта фермента с растворителем до минимума, чтобы уменьшить его инактивацию. Максимального сокращения продолжительности контакта осадка с растворителем можно достичь в непрерывных осадителях.