Глава II. Материалы и методы

Объект исследования. Объектом изучения служили лимфоциты, выделенные из периферической крови здоровых доноров. Забор крови (5 мл) осуществлялся путем венопункции кубитальной вены. Кровь забирали в пробирки, содержащие антикоагулянт Na₂-гепарин. Забор крови проводился в поликлинике инфекционно-аллергических заболеваний, Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии.

Выделение Т-лимфоцитов. Собранные образцы кровиразводили физиологическим раствором: 2 мл ФСБ + 3 мл крови. Осторожно перемешивали и медленно наслаивали разведенную кровь на 5 мл градиента плотности фиколла-400 (r=1.077 г/см). Центрифугировали в течение 40 минут при 3000 об/мин при комнатной температуре (Eppendorf 5810 R). При разделении лимфоциты образуют плавающее кольцо на поверхности фиколла. Дозатором отбирали кольцо лимфоцитов и переносили в чистые пробирки. Лимфоциты отмывали 5 мл физиологического раствора: центрифугировали 10 минут при 2000 об/мин (Eppendorf 5810R). Супернатант сливали, осадок суспенизировали раствором фосфатно-солевого буфера (5 мл) и центрифугировали 10 мин при 2000 об/мин (Eppendorf 5810 R).

Получение экстракта гранул из цитоплазмы лимфоцитов. лимфоциты промывали в 1 мл 0.32 М сахарозы в 0,01 М трис-буфере, рН 7,3 и 1 мл 0.003 М CaCl₂ в 0.01 М трис-буфере, рН 7,3. Центрифугировали при 5000 об/мин в течение 20 мин на центрифуге К-24. К полученному осадку добавляли 1 мл 0.01 М трис-буфера рН 7,3 и разрушали клетки в стеклянном гомогенизаторе Поттера 2 мин (в "ледяной бане”), добавляли 3 мл 0.01 М трис-буфера и оставляли на 30 мин в "ледяной бане”. Центрифугировали в течение 15 мин при 2300 об/мин, 4°С (Eppendorf 5810R), отбирали супернантант. Осадок промывали в 1 мл 0.01 М трис-буфере и центрифугировали в течение 15 мин при 2300 об/мин (Eppendorf 5810R). Собирали супернатант. Процедуру повторяли еще один раз. супернатанты объединяли, таким образом, был получен "постядерный" супернатант. Готовили раствор фиколла (r=1.080 г/см). Полученный раствор центрифугировали при 19500 об/мин в течение 10 мин на центрифуге Beckman (с ротором SW55). Поверх полученного градиента перколла наслаивали 2.5 мл "постядерного” супернатанта и центрифугировали при 19500 об/мин в течение 35 мин. Для удаления фиколла, центрифугировали при 45000 об/мин в течение 2,5 часов при 4°С, при этом образовывался плотный осадок фиколла.

Надосадочную жидкость, в которой содержатся секреторные гранулы, отбирали для дальнейшей работы.

Электрофорез. Диск-электрофорез проводили в денатурирующих условиях (с ДСН) в 8% разделяющем геле.

Сначала собирали камеру для электрофореза (BioRad). Затем готовили 8% разделяющий гель по схеме:

Разделяющий гель заливали между стеклами камеры, не доводя до верха 2 см, и оставляли полимеризоваться 40 мин.

Готовили 4,5% концентрирующий гель по схеме:

Наносили концентрирующий гель поверх застывшего разделяющего геля и вставили гребёнку. Оставили полимеризоваться 20 мин.

После полимеризации устанавливали стеклянную камеру в аппарат для электрофореза, заливали камеру электродным буфером, убирали гребенку.

Образцы готовили по схеме:

Пробы прогревали на водяной бане при 96^ОС в течение 3 мин, с последующим охлаждением до 20^О С.

Режим проведения электрофореза:

Вносили в кармашки по 20 мкл проб.

Электрофорез вели при постоянной силе тока. До входа образцов в Р.Г. - ток 20 мА, основной режим - 40-45 мА. Когда полоса БФС дошла до границы геля, электрофорез останавливали.

После электрофоретического разделения гель помещали в кристаллизатор, содержащий раствор 7% уксусной кислоты и 20% спирта (1ч - 24ч) для фиксации.

Окрашивание серебром. Гель отмывали четыре раза по 5 мин в б/дН₂О. Гель переносили на 20 мин в 50% -ный раствор этилового спирта, затем ополаскивали в течение 5 мин в б/дН₂О. Переносили в раствор 50% -ного спирта, содержащего 0,05% формальдегида, на 15 мин, отмывали 5 мин в б/дН₂О, вновь переносили в 50% -ный раствор этилового спирта, отмывали два раза по 5 мин в б/дН₂О. Воду сливали и гель заливали свежеприготовленным раствором аммиачного серебра. Для получения 100 мкл красящего раствора (0,36-0,4) г азотнокислого серебра растворяли в 50 мл б/дН₂О, добавляли 100 мкл 45% -ного NaOH и титровали до полного растворения коричневого осадка 10% -ным раствором свежеприготовленного аммиака (не более 2 мл!), доводили общий объем до 100 мл б/дН₂О. Окрашивание вели не более 15 мин при постоянном встряхивании, чтобы серебро не успело осесть на поверхность геля. Гель переносили в б/дН₂О и промывали пять раз по 1 мин. Заливали свежее приготовленным раствором проявителя, содержащим 0,038% формальдегида / 0,005% лимонной кислоты. Если белковые полосы не проявлялись, гель отмывали в 0.5% растворе красной кровяной соли, промывали в б/дН₂О, пока гель не станет прозрачным, и повторяли процедуру окрашивания серебром. Время появления полос (»6 мин). Гель промывали в б/дН₂О в течение 2 ч, сменяя воду каждые»5 мин.