Методы выделения и изучения лимфоцитов

Градиенты плотности для выделения лимфоцитов из цельной периферической крови человека.

Фиколл 400 представляет собой гидрофильный полимер сахарозы, имеющий высокий молекулярный вес. Молекулярный вес Фиколла составляет 400000. Осмотическое давление его растворов ниже, чем растворов сахарозы эквивалентной концентрации, что позволяет использовать изотонические градиенты плотности и сохранять физиологические и морфологические свойства клеток и органелл в процессе центрифугирования. Фиколл 400 широко применяется в каждодневной работе с разделением клеток крови и для разделения клеток и органелл путем осаждения под действием силы тяжести. [5]

Фиколл-пак представляет собой готовый к употреблению стерильный раствор плотностью 1,077 г/мл, используемый для выделения лимфоцитов периферической крови человека путем простой и быстрой процедуры Фиколл-Пак представляет собой смесь Фиколла 400 (5.7 % вес/объем) и диатризоата натрия (9,0 % вес/объем). Фиколл-Пак используется для выделения лимфоцитов при определении тканевой совместимости и цитотоксичности. Процедура выделении позволяет получать высокий выход жизнеспособных лимфоцитов без нарушения соотношения между Т - и В-клетками.

Перколл - уникальная среда для центрифугирования в градиенте плотности, специально предназначенная для поддержания физиологических условий в процессе центрифугирования. Среда представляет собой стерильный коллоидный раствор частиц двуокиси кремния, покрытых поливинилпирролидоном (ПВП). Перколл нетоксичен для клеток и может образовывать градиенты с плотностью в диапазоне до 1,3 мг/мл. Градиенты можно преформировать, либо они формируются спонтанно при центрифугировании. Перколл имеет низкую осмоляльность (20 мосм/кг H₂O), благодаря чему на протяжении градиента фактически поддерживаются физиологические условия. Вследствие большого размера частиц центрифугирование раствора перколла при умеренных скоростях приводит к формированию градиента плотности. Поэтому разделение обычно происходит очень быстро. Среда, используемая для центрифугирования, может быть изотоничной по всему объему благодаря включению в нее солей или сахарозы. Не составляет труда создать пологий градиент, что позволяет проводить весьма эффективное разделение мембранных фракций по их плавучей плотности.

Свойства перколла:

.   Диапазон плотностей пригоден для равновесного центрифугирования клеток, вирусов и субклеточных частиц с константой десиментации > 70S.

2. Устанавливается на физиологическую ионную силу и pH.

.   Низкая вязкость.

.   Не проникает сквозь биологические мембраны.

.   Может быть стерилизован многократно.

.   Совместим с биологическими материалами.

.   Легко отделить от очищенного материала.

.   Нет существенного эффекта гашения при регистрации радиоактивности. [5]

Ультрацентрифуга

Ультрацентрифуги - наиболее узкоспециализированный тип приборов, служащий главным образом для исследовательских задач, седиментации вирусов, выделении субклеточных структур, белков и других высокомолекулярных соединений, нуклеиновых кислот и, в целом, разделения частиц размером 100 нм и менее. Принцип работы ультрацентрифуги аналогичен остальным лабораторным центрифугам, но по своим техническим параметрам они значительно превосходят все лабораторные модели. Они способны достигать скорости 150 000 об/мин и ускорения свыше 1 000 000g. Кроме угловых и бакетных роторов, центрифуги могут оснащаться проточными или зональными роторами с одной большой внутренней полостью для разделяемой жидкости. По исполнению ультрацентрифуги могут быть как настольными, так и напольными. Производятся приборы данного класса компаниями Beckman Coulter и Thermo Scientific.

Мы использовали ультрацентрифугу компании Beckman Coulter Optima^TM L-series.

Напольные ультрацентрифуги серии Optima L способны работать на скорости 100 000 об/мин (L-100K) с ускорением до 694000×g/802000×g (табл.1). Центрифуги комплектуются огромным рядом угловых и горизонтальных роторов, снабжены надёжным вакуумированным индукционным приводом, системой управления и контроля на базе микропроцессора и безопасной для окружающей среды системой охлаждения, в которой не используются фторированные углеводороды или другие жидкие хладагенты, встроенной системой коррекции дисбаланса ротора до 10%. Серия Optima L в полной мере соответствует установленным требованиям при работы с биологически опасными материалами, имеются соответствующие сертификаты на биобезопасность на нескольких уровнях. Центрифуги подключаются к сети 220В, что позволяет размещать их в любом удобном месте. [6]

Таблица 1. Технические характеристики ультрацентрифуг серии Optima L