Другие исследования животных

В обширной книге Котта по общей фотографии животных [6.65] имеются соответствующие обсуждения инфракрасного воспроизведения. Для многих животных модели инфракрасного отражения не имеют отношения к видимой области. При исследовании многих животных Котт обнаружил, что защитный фактор окраски, как правило, не распространяется на инфракрасную область. Однако, используя черно-белую пленку, он нашел, что некоторые гусеницы обладают эффектами отражения ИК-излучения, схожими с теми, какими обладают маскирующие их листья. Однако даже такие гусеницы можно различить с использованием цветной инфракрасной фотографии, проведенной согласно Гиб-сону с сотр. {6.103], которые также обнаружили, что вкрапленная меланиновая пигментация у лягушек и жаб выглядит голубой, выделяясь на фоне их маскировочных цветов. В книге Котта имеется иллюстрация, которая показывает гнездующуюся утку, безопасно скрытую на панхроматической фотографии, но совершенно отчетливо заметную на черно-белой инфракрасной фотографии. Данный вид фотографии может использоваться при подсчете диких животных. Работа Колузлла и его коллег по идентификации и подсчету одомашненных стад с воздуха обсуждается в гл. 9.

ГЛАВА 7.
Инфракрасная микрофотография

Микроскоп находится в первом ряду приборов, которые доказали свою ценность как инструменты для научных и технических: исследований. До изобретения фотографии единственный путь получения неизменной картины того, что видит наблюдатель в свой микроскоп, состоял в выполнении зарисовки. Эту операцию, несмотря на то, что она давала очень элегантные результаты в руки тех ученых, кто также был и хорошим художником, нельзя считать такой, которая дает безошибочные результаты воспроизведения всех наблюдаемых подробностей или соответствующие тоновые величины наблюдаемых деталей. Кроме того, на выполнение рисунков необходимо время. До фотографии не было средств быстрой и точной записи изображения в микроскопе, и не удивительно, что практически первое использование фотографии в научной области заключалось в получении таких изображений. В 1802 г. Веджвуд и Деви выполнили микрофотографии на белой коже, пропитанной нитратом серебра, используя так называемый солнечный микроскоп, однако они не могли закрепить их. Первые фиксированные микрофотографии были выполнены в 1837 г. Ридом, который открыл способ закрепления с помощью гипосульфита.

Путем искусного понимания особенностей использования микроскопа и знания свойств фотографических пленок и пластинок специалистам по фотографии удается получать результаты, воспроизводящие очень мелкие детали с предельной ясностью. Они полностью понимают условия, необходимые для получения таких результатов; с помощью светофильтров они могут регулировать. в любой желаемой степени контраст частей объектов, окрашенных в разные цвета, чтобы повысить информативную ценность микроскопического изображения.

В 1926 г. на лекции в Институте Франклина в Филадельфии, посвященной чувствительности фотографических материалов к цвету, Меес [7.19] сделал следующее пророческое высказывание относительно микрофотографии: До совсем недавнего времени микроскоп оставался инструментом для визуальных наблюдений, микрофотографические методы применялись только для фиксирования видимого изображения. Кажется вероятным, что скоро микроскоп в свою очередь станет фотографическим инструментом, причем визуальные наблюдения будут использоваться лишь для того, чтобы направлять инструмент на фотографирование невидимого. -

Рис. 7.1.

Слева — микрофотография волоса человека, выполненная на панхроматической пленке; справа — тот же волос, снятый на инфракрасную пленку. Необходимо отметить, как инфракрасное излучение проникает через кератин. Даже когда снимки печатаются с одинаковой максимальной плотностью для сердцевины, инфракрасное излучение показывает несколько большее проникновение, чем свет.

Меес имел в виду конкретное использование в микрофотографии невидимого ультрафиолетового излучения. Его замечания могли также относиться к невидимому ИК-излучению на другом конце спектра, если бы в то время были доступны современные фотографические материалы и пластинки, чувствительные к ИК-излучению. Однако ценность использования инфракрасного излучения в микрофотографии заключается не в увеличении разрешающей способности, как это имеет место при использовании ультрафиолетового излучения (ибо она реально меньше для инфракрасного излучения), а в большей прозрачности многих материалов к ИК-излучению. Нет пользы в большом разрешении, если фотографируемый объект непрозрачен; разрешающую способность можно принести в жертву, если имеется средство проникновения через непрозрачные детали (Бекстрем [7.2]).

Гораздо раньше Меес изучал красители, широко используемые для окрашивания биологических объектов в микроскопических исследованиях, и установил основные правила, согласно которым необходимо фотографировать окрашенные срезы, чтобы получать наилучшее воспроизведение в деталях и контрасте. Принципы, которые он положил в основу, следующие:

1. Чтобы достичь максимального воспроизведения деталей, необходимо фотографировать объект в свете, который проходит через него или через краску.

2. Чтобы достичь максимальной контрастности, необходимо фотографировать объект в свете, который поглощается краской.

Эти принципы применимы к инфракрасной микрофотографии в такой же степени, в какой они применимы к фотографии в видимом свете. Однако большинство биологических красителей, используемых для микроскопии в видимом свете, являются очень прозрачными к инфракрасному излучению. Следовательно, чтобы достичь удовлетворительного воспроизведения контраста в инфракрасной области, необходимо выбрать другие красители, которые поглощают инфракрасное излучение в той области спектра, где данная пленка является чувствительной. Если надо получить удовлетворительное воспроизведение деталей, то в этой области объект должен быть прозрачным к инфракрасному излучению. В этом отношении инфракрасная микрофотография оказалась особенно полезной, поскольку многие материалы, которые не прозрачны в видимой области, являются прозрачными в инфракрасной области (рис. 7.1).

ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ

В пределах объема данной книги невозможно описать методы выполнения микрофотографий в видимом свете. Предполагается, что с этим читатель знаком или что ему доступны одна или несколько книг, посвященных данной теме. (См. работы [7.11, 7.29, 7.33, 7.45].)

В данном разделе обсуждаются общие методы экспонирования и фокусировки, а также обращения с источниками инфракрасного излучения и фильтрами. Вводятся понятия люминесценции, а также микрофотографии и киномикрографии в измененных цветах. Некоторые дополнительные специальные технические факторы, относящиеся к специфическим приемам, включены в раздел по применениям.

Исследования, касающиеся методов и применения инфракрасной микрофотографии, были начаты давно. Поэтому в более поздней литературе иногда приводятся снимки без описания подробностей используемого метода. В дополнение к инфракрасному фотографированию для обнаружения подробностей во многих образцах часто используется микрорадиография на основе мягкого рентгеновского излучения. (Для полного знакомства с этими радиографическими методами см. работу [7.59].) Новые пути были открыты при использовании тепловых чувствительных элементов:в длинноволновой инфракрасной области; они не связаны с прямой инфракрасной съемкой [7.57, 7.61]. Тем не менее все еще имеется много областей, в которых использование инфракрасной фотографии может оказаться более простым и полезным (Шиллабер [7.43]). Использование цветной микрофотографии стимулировало и способствовало проведению многих исследований.

Первые попытки микрофотографии в длинноволновом диапазоне спектра, по-видимому, были предприняты Келером в 1912— 1913 гг. Так как в то время еще не было в продаже пластинок, чувствительных к инфракрасному излучению, он использовал пластинки Wratten Process Panchromatic, ограничив с помощью светофильтров экспозицию длинами волн в области выше 640 нм. Пластинки же были чувствительны в области не выше 710 нм, так что фотографии фактически были выполнены с помощью темно-красного света, а не ИК-излучения [7.3].

В период 1927—1929 гг. Калзавара, Бертран с сотр. [7.4, 7.5,. 7.8, 7.9] опубликовали ряд работ, в которых они достаточно полно обсудили проблемы ИК-микрофотографии. Они ясно сформулировали условия, необходимые для получения хорошего контраста и деталей; микрофотографический метод, который они использовали, базировался на следующих соображениях:

1. Инфракрасное излучение обладает характерными особенностями в диапазоне 760—1000 нм. В этом диапазоне излучение- меньше преломляется средой, чем излучение с более короткими длинами волн, и может проникать сквозь многие среды, которые не прозрачны для видимого света.

2. Необходима сенсибилизация эмульсий в инфракрасной области цианиновыми красителями, которые делают чувствительными обычные пластинки в области, далеко отстоящей от области: их собственной чувствительности.

3. Необходимо использование фотографических сенсибилизаторов, например гистологических красящих веществ, таким образом, чтобы кривая поглощения красителя точно совпадала с областью чувствительности эмульсии.

4. Использование фильтра для исключения излучения с длинами волн, отличными от тех, к которым сенсибилизирована пленка, таким образом, чтобы оставалось только то излучение, которое включает одновременно как области поглощения красителя, так и область чувствительности пленки.

В практике этих авторов криптоцианин использовался одновременно как краситель и как сенсибилизатор для данной фотографической пластинки. Апохроматический иммерсионный объектив, с числовой апертурой 1,30 применялся в сочетании с апланатическим конденсором с апертурой 1,4 и окуляром Zeiss Homal 4. В качестве источника была выбрана лампа накаливания с силой света 600 кд с относительно малой диафрагмой для использования лишь тех лучей, которые близки к оптической оси. Применялись светофильтры Kodak Wratten № 88, 88А и 87. Наводка на резкость осуществлялась визуально, а затем для гарантии резкости в ИК-области проводилась подстройка на величину, которая" определялась предварительно выполнением ряда снимков при различных положениях настройки (способ, который используется № дальнейшем).

Книга [7.4] содержит большое число отличных репродукций: микрофотографий, полученных описанным выше способом; в ней также обсуждается значение этого метода для морфологии и гистологии. Авторы, в частности, отметили особенности почечной цитологии. В других работах [7.4, 7.5] описано практическое приложение микрофотографии к различным исследованиям по цитологии, в частности рака, и центральной нервной системы в нормальных и патологических условиях.

Может показаться, что результаты, полученные этими исследователями, можно получить использованием панхроматических пленок и фильтров с узкими полосами пропускания. Однако они отметили, что при использовании их методов следовало ожидать лучших результатов, так как имеются инфракрасные сенсибилизаторы, которые дают крайне узкие изолированные полосы поглощения и чувствительности на тех же самых длинах волн, которые имеют соответствующие красители. С помощью обычных красителей, панхроматических эмульсий и светофильтров было крайне трудно выделить фотографическую спектральную область, которая бы близко соответствовала нужной части характеристики красителя.

С точки зрения современных знаний о сенсибилизирующих красках и светофильтрах, по всей вероятности, выделение такой спектральной области можно провести более удовлетворительно, чем в то время, когда Калзовара и Бертран проводили свои исследования и вывели четыре своих основных принципа. Автору не удалось найти работы по окрашиванию с использованием новых сенсибилизирующих красок для пленок, которые обсуждаются в гл. 3. Вероятно, до сих пор эффективен криптоцианин.

Микрофотографирование в ИК-лучах в том виде, в котором оно обычно выполняется в настоящее время, по существу почти не отличается от микрофотографирования с помощью света. Источник излучения выбирается таким образом, чтобы имелось достаточно энергии в области, в которой чувствительны эмульсии; используемые светофильтры обычно выделяют желаемую спектральную область экспозиции. Красители, поглощающие ИК-излучение, используются или не используются в зависимости от желания контраста или воспроизведения мелких элементов.

Лампы и фильтрация

Источники, которые обычно применяются в черно-белой микро-«фотографии, пригодны и для выполнения черно-белой ИК-микрофотографии. В случае черно-белого фотографирования пучок света необходимо отфильтровать красным или непрозрачным для видимого излучения фильтрами, однако в этом нет необходимости при цветных методах.

В некоторых немногочисленных случаях микрофотографирование бывает выгодно осуществлять как в проходящих, так и в отраженных лучах. При этом следует отфильтровать оба освещающих пучка. В работах, приведенных в списке литературы к данной главе, в частности [7.36, 7.39, 7.40, 7.43], имеются большие разделы, затрагивающие вопросы освещения и фильтрации для черно-белой и обычной цветной микрофотографии. В них можно получить сведения по наладке микроскопа для проведения черно-белой инфракрасной съемки.

Лампы и фильтры для фотографирования в измененных цветах. Фотографирование на инфракрасную цветную пленку обсуждается в работах [7.34—7.37]. Этот новый метод требует специального рассмотрения осветителей и нового подхода к оценке действия фильтров. Импульсная ксеноновая дуга обеспечивает удовлетворительное освещение для цветной инфрапленки. Галогенные лампы и электронные вспышки также доказали свою пригодность для микрофотографии. Конечно, необходим обычный желтый фильтр.

Так как цветная инфрапленка весьма чувствительна, может возникнуть необходимость в уменьшении интенсивности света с помощью нейтральных светофильтров. Требуемая степень нейтральной плотности достигается применением и углеродных, и серебряных фильтров. Их соотношение по плотности должно составлять две доли серебряных к одной углеродной, чтобы выдержать цветовой баланс освещения, установленный для цветной пленки.

Фильтр нейтральной плотности Kodak Wralten № 96 (желатин) можно использовать в паре с серебряным фильтром. Поставляемый фильтр № 96 работает в интервале плотностей 0,1—4,0. Серебряные фильтры можно заказать в фотомагазинах. К ним относятся Kodak Flash Densities (на пленке) размером 10X12 или 20X25 см. Следует указать желаемую плотность: имеются фильтры с диапазоном плотности 0,05—4,06. Так как серебряные фильтры рассеивают свет, они должны использоваться только в пучке освещения, а не в пучке, формирующем изображение. В установке для микрофотографирования все фильтры должны помещаться между лампой и образцом (исключая те случаи, когда должны выполняться инфракрасные эмиссионные фотографии).

Любой светофильтр, находящийся в интенсивном световом пучке, необходимо периодически проверять на выцветание, обусловленное воздействием света и тепла. В тех случаях, когда выцветание происходит слишком быстро, следует найти для фильтра местоположение, где более прохладно (обычно там, где пучок более широкий). Другим возможным вариантом является попытка использовать фильтр нейтральной плотности фирмы Kodak (покрытый инконелем). Его поглощение достаточно нейтрально для инфракрасной цветной фотографии, и его можно использовать как в пучке, формирующем изображение, так и в пучке освещения. Фильтр, нанесенный на стекло, обычно является вполне подходящим для этих целей. Его можно поместить в довольно горячую среду; кварц с покрытием может противостоять даже еще большему нагреву. Фильтры, покрытые инконелем, продаются непосредственно по адресу: Special Products Sales, Kodak Apparatus Division, Rochester, New York 14650.

Описание некоторых характерных исследований укажет рабочие методики для инфракрасной цветной микрофотографии. Гибсон (в работе [7.35]) выполнил эксперименты с двумя наиболее часто используемыми типами источников света: ксеноновой дугой (с фазово-контрастным микроскопом) и галоидной лампой накаливания (с обычным микроскопом). В обоих случаях оставляли теплопоглощающее стекло в лампах, так как оно пропускает большую часть актиничного инфракрасного излучения. В пучок, естественно, помещался светофильтр Kodak Wratten № 12.

В случае ксеноновой дуги, чтобы сбалансировать освещение для достижения приемлемого нейтрального фона, требуется цветной компенсирующий фильтр CC5OR (красный) фирмы Kodak. При использовании галоидной лампы накаливания требуются фильтры СС5ОС-2 (циан) и CC2OR. Вообще не существует фильтра, чтобы поднять цветовую температуру до температуры дневного света, который можно было использовать в сочетании с галоидной лампой, так как наибольший эффект в этом отношении дал бы фильтр № 12, но пропускание зеленой компоненты которого ослабило бы результаты. Все же такие фильтры можно попытаться использовать для специальных разделений. Вейсс (в работе [7.37]) использовал 6-вольтовую лампу с ленточной нитью накала и светофильтры № 12, 80А и 82А для изучения неокрашенных грибковых препаратов в воде при яркопольном освещении. В этой лампе теплопоглощающего стекла не было.

Фотограф может установить свой собственный баланс для таких ламп и для других вольфрамовых источников накаливания введением в установку пробных фильтров. При этом следует иметь в виду эффект перевода цвета пленки. Зеленые фильтры приводят к фуксиновому цвету, красные — к желтому, а избыток инфракрасного излучения — к красному. Когда фон выглядит слишком голубым на диапозитиве, это значит, что имело место слишком сильное пропускание зеленых лучей (поглощение красных и инфракрасных) в оптике или в теплопоглощающем стекле. Красный цветной компенсирующий светофильтр уменьшает эту голубизну. Пурпурный фон указывает на слишком большое количество зеленого и инфракрасного излучения. Инфракрасное излучение можно уменьшить с помощью фильтра циан-2; тогда его действие на зеленый цвет и действие первоначального избытка зеленого цвета можно устранить с помощью соответствующего красного компенсирующего фильтра.

Когда фон фотографируется зеленоватым, то, вероятно, имелось слишком много красного либо в желтоватой среде препарата, либо в диффузном красителе. Это можно уменьшить применением цианового (не циан-2) компенсирующего фильтра. Коричневатый фон соответствует тому случаю, когда преобладают инфракрасное и красное излучения.

 

 

Таблица 7.1 Фильтры для цветового баланса при микрофотографии
Фоновый (свободная область) цвет на диапозитиве	Цветные компенсирующие фильтры фирмы Kodak для согласования
Голубой Пурпурный Зеленый Коричневый	Красный или фуксиновый1) Циан-21) плюс красный Циан1) или зеленый Циан-21)
1) Желтый светофильтр № 12 перекрывает голубое излучение, пропускаемое этими фильтрами.

Фильтр циан-2 регулирует этот эффект. Присутствие желтоватой сыворотки приводит обычно к желтовато-коричневому фону.

После установления баланса фильтров и степени экспонирования для любой установки фотографирование на ней выполняется непосредственно для ряда подобных образцов. В тех случаях, когда фотографируются разные микропрепараты, необходимо судить, будут ли необходимы данные фильтры. Результаты должны указать на необходимость проведения регулировки цветового баланса; в этом может помочь табл. 7.1. Если найдена подходящая комбинация светофильтров, то данные, касающиеся увеличения источника и экспозиции, следует записать на ярлыке к препарату для будущей или сравнительной микросъемки. Образцы наиболее распространенных тканей клеток, организмов и красок можно использовать в качестве стандартов для контроля методик.

Экспозиция

Правильная экспозиция для инфракрасной микросъемки определяется из серии пробных снимков с различными экспозициями, как обычно делают при съемке в свете. Это можно осуществить с применением измерительных приборов, например умножителя фирмы Zeiss, или просто выполнением последовательного ряда кадров на одну и ту же пленку при небольшом изменении известных интервалов времени экспозиции.

При работе с полуавтоматической камерой, имеющей экспонометр, встроенный через объектив, Гибсон (в работах [7.34, 7.35]) нашел, что необходимо установить лимб скоростей на отметку 200 для инфракрасной цветной пленки 100 ед ASA. При действии измерителя светофильтры находились в рабочем положении. Так как чувствительные элементы в измерителях изменяют свою чувствительность в зависимости от цвета или инфракрасного излучения, то необходимо проводить калибровку каждой конкретной: установки.

Эмиссионная микрофотография

При регистрации инфракрасной люминесценции небольших, образцов для выполнения несерийных фотографий пригодны используемые в микрофотографии волоконная оптика, осветительные лампы с узким пучком или фокусирующие лампы, с помощью» которых возможно освещение малых площадей. Однако их необходимо закрывать или экранировать для предотвращения утечки рассеянного света. Зелено-голубые фильтры следует достаточно хорошо подогнать, чтобы устранить возможность утечек света.

Инфракрасную люминесценцию срезов микроскопических объектов можно заснять на стандартной установке для микросъемки. (Гибсон [7.51]). Следует использовать освещение Кёлера. Светофильтры возбуждения помещаются на пути света между лампой; и конденсором. Инфракрасный фильтр (Kodak Wratten № 87) помещается на окуляре.

В качестве примерной экспозиции, найденной для срезов дентина человека, предлагаются следующие параметры: увеличение 90, числовая апертура 0,35—15 мин для высокочувствительной, инфракрасной пленки.

Было обнаружено, что расщепитель луча можно не использовать. Экспозиции были настолько длительными, что окуляр этого; прибора создал на пленке изображение темной комнаты.

Микрокиносъемка

В работе [7.371] приведена подробная информация об основной схеме установки для микрокиносъемок. В работах Вагнера и Филли [7.64], а также Вагнера с сотр. [7.65] описывается метод, исследования циркуляции крови в легких животных. Показана схема расположения предметного окна микроскопа, освещения и камеры. Эти работы содержат исчерпывающую библиографию приложений и методов. Данную методику можно было хорошо; приспособить к исследованиям, выполняемым с цветной инфрапленкой, особенно с точки зрения пригодности для дифференцирования венозной и артериальной крови (Гибсон [5.112, 5.163]).

ФОКУСИРОВАНИЕ

При цветном фотографировании получение четкого изображения обеспечивается обычным путем. Однако для черно-белых; снимков, изображения на которых целиком формируются инфракрасным излучением, получение хорошего фокуса представляет специальную и важную проблему. Из кривых хроматической аберрации для апохроматических и ахроматических объективов следует, что первые намного предпочтительнее для инфракрасной микрофотографии (гл. 3). При использовании апохроматов, вероятно, нет необходимости в коррекции фокуса, полученного визуально с темно-красным фильтром, например Kodak Wratten № 29. Однако большинство инфракрасных микрофотографий выполняется при низкой освещенности, когда пригодны лишь ахроматические объективы, и остаточная хроматическая аберрация ахроматов может потребовать существенной перенастройки фокуса для инфракрасного излучения. Эти объективы очень сильно отличаются друг от друга, и поэтому необходимая коррекция будет зависеть от особенностей используемого объектива. Потеря резкости имеет место при применении полного спектра длин волн ИК-области.

На практике для получения хорошей фокусировки применяется несколько методов:

1) фокусирование изображения камеры визуально в красном свете;

2) фотографическая калибровка точной наводки и использование коррекции;

3) метод коррекции Науманна.

В первом методе изображение фокусируется визуально на матовое стекло при красном фильтре. Экспонирование производится через фильтр, и при этом используется лишь инфракрасное излучение из области, находящейся в непосредственной близости к видимому спектру. (О фильтрах см. в гл. 2 и 3).

Если желательно ограничить экспозицию излучением более длинных волн, то для фотографирования необходимо использовать фильтр, который имеет «отсечку» на более длинных волнах и слабо пропускает или вообще не пропускает видимое излучение. В этом случае фокусировка производится с красным фильтром, а при экспонировании он заменяется инфракрасным. Крафт. [7.17] описал разновидность этого метода. Он применил комбинированный фильтр, состоящий из красного шоттовского стекла RG5 толщиной 2 мм и голубого шоттовского стекла ВОЗ толщиной 2 мм. Для фотографирования в области 800—1000 нм визуальная установка на резкость производилась только сквозь один красный фильтр. Голубой фильтр, который поглощает красное, но не поглощает инфракрасное излучение, добавлялся к красному при экспонировании. Комбинация из двух светофильтров пропускала излучение в области с длиной волн больше чем примерно 750 нм, которая находится за краем видимого красного излучения. В тех случаях, когда фотографирование производится в инфракрасной области с более длинноволновым излучением и особенно когда применяются ахроматические объективы, может возникнуть необходимость в использовании второго метода фокусирования.

Во втором методе пробный образец помещается на столик микроскопа и фокусируется визуально в зеленом свете обычным путем, при этом отмечается положение точной наводки. Затем инфра-красный фильтр ставится на свое место и выполняется ряд инфракрасных экспозиций при различных положениях относительно точной наводки. Сравнение негативов позволяет сделать выбор того, на котором фокусирование лучше. И тогда делается отметка разницы в положении точной наводки для наилучшего визуального и фотографического фокусов. При последующем фотографировании объект фокусируется визуально, а затем перед экспонированием делается поправка на эту разницу. В результате получается четкий негатив.

Модификацией этого второго метода является третий метод, разработанный Науманном [7.20]; это наиболее часто используемый метод. Из анализа кривой остаточной хроматической аберрации ряда хроматических и апохроматических объективов (скорректированных для 486,1 и 656,3 нм) он сделал заключение, что разница в фокусе между длинами волн 540 (соответствует минимуму на кривой) и 680 нм равна примерно половине разницы в фокусе между этой длиной волны и длиной волны инфракрасной области при 820 нм. Если проверкой найдено, что это соотношение имеет место для используемого объектива, то для фокусировании в инфракрасной области можно применить следующий метод. Сначала объект фокусируется визуально в зеленом свете с помощью светофильтра, имеющего максимум пропускания при 540 нм (Kodak Wratten № 58, 58А или 61; Ilford Tri-colour, зеленый; Agfa № 70). Затем производится фокусирование визуально в красном свете с фильтром немного темнее, чем нормальные трехцветные красные фильтры (Kodak Wratten 29; Ilford Spectrum, красный; Agfa № 42 или 82). Разница между установками на точный фокус замечается и винт точной наводки еще поворачивается дополнительно в том же направлении, что и в случае красного фильтра, на расстояние, равное этой двойной разнице после числа, соответствующего красному светофильтру. В этом случае инфракрасное изображение должно быть в фокусе. Однако этот показатель различен для разных ахроматов. В свою очередь некоторые апохроматы требуют наводку в 1,4 этой разницы. В таких случаях знание этих наводок облегчает применение второго метода. После нахождения инфракрасного индекса для последующей работы образец фокусируется в зеленом свете (ручка регулировки вращается в направлении инфракрасного индекса). Затем производится коррекция вращением в ту же сторону. При этом следует избегать проскальзывания.

Конструкторов или тех, кто работает со сложным оборудованием, может заинтересовать модификация третьего метода, осуществленная Р.П. Ловеландом и М.X. Херцбергером (частное сообщение). Они уточнили коррекцию Науманна, основывая величины на фокальных девиациях, рассчитанных Херцбергером (гл. 3). Для «Микротессар» фирм Bausch and Lomb и Zeiss они применяют следующую методику (она, вероятно, применима и к «Микросуммар»).

Таблица7.2

Получение корректирующих отношений

Фокус	Фильтр	Центральная длина волны, нм	Относительное отклонение фокуса для линии Не (587,6 нм)
1-й фокус	Wratten 90 плюс CuSO4	580	0,000034
2-й фокус	Wratten 29	635	- 0,000290
(вариант)	Wratten 70	690	- 0,000798
3-й фокус	Wratten 87 и инфракрасная пластина	820	- 0,002347
Для удобства умножаем все девиации на 10-6.

 

	Разница, нм
1. D(90-29)	324
2. D(29-инфакрасный)	2057	6,3
3. D(90-70)	832
4. D(70-инфакрасный)	1549	1,86

Необходимо отметить, что фокус при использовании комбинации фильтров с пиком при 580 нм дает положительную действительную девиацию от рассчитанного значения для фокуса при 587,6 нм. Поэтому, когда, например, используется фильтр № 29, к отрицательной девиации 290 надо прибавить 34, чтобы найти относительную разницу для величин, входящих в данное отношение.

Для высокоэффективного зеленого фильтра, имеющего узкую полосу пропускания, они использовали комбинацию фильтра Kodak Wratten № 90 с жидким фильтром из сульфата меди (CuSO4 в 5%-ном растворе) толщиной 10 мм. При добавлении сульфата меди в холодную воду и другой толщине камеры необходимо ввести соответствующие изменения в концентрации. Данные этого метода приведены в табл. 7.2. При его использовании микроскоп прежде всего фокусируется визуально через зеленый светофильтр Kodak Wratten № 90+CuSO4 и положение фокуса на шкале наводки отмечается как нулевое. После этого данные фильтры заменяются красным фильтром (предпочтительнее Kodak Wratten № 70) и микроскоп перефокусируется (после того как фокус лупы для проверки изображения на матовом стекле устанавливается от зеленого к красному). Чтобы перейти от красного фокуса к инфракрасному, необходимо числовое значение сдвига, получен ное по шкале отсчета точной наводки при переходе от зеленого фокуса к красному, умножить на соответствующий коэффициент, приведенный в таблице. Затем шкалу вращают дальше (из положения, соответствующего красному фокусу) на величину, полученную в результате умножения, чтобы достичь положения инфракрасного фокуса, вновь избегая проскальзывания.

Соуни [7.63] разработал фотографический метод определения инфракрасного фокуса. Он помещает микропрепарат на столик микроскопа и наклоняет его на небольшой угол, который зависит от рабочего расстояния объектива. Вначале шкала фокусируется визуально на линию вблизи центра поля зрения (линия А). Отмечается число на указателе точной наводки и производится съемка инфракрасного негатива. На снимке находят другую линию, которая выглядит наиболее четко (линия В). Затем микроскоп перефокусируется на линию В. Результирующее число на указателе определяет величину необходимой коррекции после визуального фокусирования образца с объективом, который таким образом оказывается проверенным.

Так как второе число было получено при визуальном фокусировании (соответствуя фокусировке образца), требуемая коррекция производится в обратном направлении к первому, визуальному фокусу линии А, что дает четкое фотографическое изображение линии В. Таким образом, визуально фокус находится на интересующей детали образца; это делает более глубокий слой четким в инфракрасных лучах. Затем производят коррекцию таким образом, чтобы менее глубокий слой стал визуально четким; это приводит к тому, что интересующий слой оказывается сфокусированным в инфракрасных лучах.

Соуни также приводит схему расчета перемещения раздвижных мехов, необходимого для получения того же увеличения, что было бы для видимого излучения с теми же оптическими компонентами. Те же результаты можно получить фотографическим методом последовательных приближений. Предмет в визуальном фокусе измеряют на матовом стекле. Затем можно выполнить четкие скорректированные инфракрасные негативы при различных растяжениях мехов, чтобы найти такое положение, которое соответствует визуальным измерениям. Когда такой точности при фотографировании не требуется, можно по крайней мере оценить фактическое инфракрасное увеличение путем сравнительных измерений инфракрасных негативов и визуального изображения на матовом стекле.

Предпочтительным является освещение Колера. Нить канала обычно фокусируют на находящуюся под микроскопическим столиком ирисовую диафрагму через светофильтр Kodak Wratten № 87, который следует использовать при фотографировании, так как он пропускает достаточно красного света для обеспечения сумеречного видения. Вместо него можно использовать красный. светофильтр № 29, после того как первоначально была проведена фокусировка с зеленым фильтром № 61. Передвижение конденсора, которое требуется для перехода от красного фокуса к инфракрасному, практически совпадает по величине и направлению с - тем, которое необходимо для перехода от зеленого фокуса к красному.

ПРИМЕНЕНИЯ

Инфракрасная микрофотография применяется как дополнение к другим фотографическим методам исследования, и ссылки на такие применения приведены в предыдущих главах. В данном разделе обсуждаются исследования, которые базируются в основном на микрофотографии.

Биологические исследования

Большинство работ в этой области было выполнено в энтологии, цитологии, гистологии, эмбриологии и ботанике. Обычно инфракрасные микрофотографии глубоко пигментированных тканей и толстых микроскопических срезов и образцов дают представление о подробностях внутренней структуры, не видимых на обычных микрофотографиях.

Особый интерес в этой связи представляют снимки насекомых, большое число которых опубликовано различными исследователями. Многие насекомые содержат темный хитиновый покров, который делает исследования в свете крайне затруднительными1) (рис. 7.2). Для фотографирования в видимой области образцы обычно отбеливаются, например, с помощью углекислого калия; эта обработка требует времени и осторожности, так как может привести к повреждению препарата. Микрофотографии, выполненные в инфракрасных лучах с неотбеленных объектов, также очень часто позволяют выявить много подробностей, как и фотографии, выполненные в свете на отбеленных объектах. В некоторых случаях образец бывает настолько толстым, что инфракрасные снимки не позволяют выявить всех желаемых деталей, и тогда необходимо прибегать к рентгенографии в мягких рентгеновских лучах. Однако это предполагает использование дорогого радиографического оборудования, и инфракрасные методы являются предпочтительными, если они приводят к желаемым результатам.

Даже в случае ископаемых граптолитов из Нижнего Слуриана (Diplogratus gracitis F. Roem), которые состоят из хитина, обуглившегося с течением времени, Крафт [7.17] смог выполнить микрофотографии в инфракрасных лучах, на которых образцы были воспроизведены совсем прозрачными и выделены детали тонкой структуры.

Рис. 7.2. Голова комнатной мухи, сфотографированная на инфракрасную пленку для демонстрации прохождения излучения че