Тестируемые антибиотики и диапазон разведений

Антибиотик	Диапазон разведений, мг/л	Стартовая концентрация, мг/л
Ампициллин	0,016-16	32
Амоксициллин/клавуланат	0,032/0,016-32/16	64/32
Триметоприм/сульфаметоксазол	0,032/0,608-32/608	64/1216
Меропенем или	0,004-4	8
Имипенем	0,016-16	32
Цефтриаксон или цефотаксим, или цефтазидим	0,008-8	16
Хлорамфеникол	0,064-64	128
Азитромицин или	0,032-32	64
Кларитромицин	0,064-64	128
Тетрациклин	0,064-64	128
Ципрофлоксацин	0,004-4	8

 

Базовый раствор антибиотика готовится из навески химически чистой субстанции препарата путем растворения ее в рассчитанном количестве растворителя для получения концентрации, превышающей стартовую концентрацию антибиотика в 100 раз (например, 3200 мг/л для ампициллина).

• Недопустимо использование лечебных препаратов вместо субстанций!

Подробно методика приготовления базового раствора изложена в приложении 4.3. Стартовый раствор антибиотика приготавливается путем добавления 0,1 мл базового раствора антибиотика к 9,9 мл НТМ бульона, 0,5 мл которого переносят микропипеткой со стерильным наконечником в первую пробирку, содержащую 0,5 мл бульона. Тщательно перемешивают и новым стерильным наконечником переносят 0,5 мл раствора антибиотика в бульоне во вторую пробирку, содержавшую первоначально 0,5 мл бульона.

Эту процедуру повторяют, пока не будет приготовлен весь необходимый ряд разведений. Из последней пробирки 0,5 мл бульона удаляют. Таким образом получается ряд пробирок с растворами антибиотиков в количестве 0,5 мл, концентрация которых отличается в соседних пробирках в 2 раза. Одновременно готовятся ряды серийных разведений антибиотика для тестирования контрольных штаммов гемофильной и кишечной палочек.

Приготовление инокулюма. Для приготовления инокулюма используют суточную культуру гемофильной палочки на шоколадном агаре. Колонии H.influenzae суспендируют в стерильном 0,9% растворе натрия хлорида до мутности, эквивалентной 0,5 по стандарту МакФарланда.

Последующее разведение этой суспензии в 100 раз готовится на НТМ бульоне, после чего концентрация гемофильной палочки составит примерно 10⁶ КОЕ/мл. По 0,5 мл инокулюма вносят в каждую пробирку, содержащую по 0,5 мл соответствующего разведения антибиотика, и в 2 пробирки с 0,5 мл НТМ бульона без антибиотика ("отрицательный контроль" и "контроль роста").

Конечная концентрация гемофильной палочки в каждой пробирке достигнет необходимой – примерно 5x10⁵ КОЕ/мл. Инокулюм должен быть внесен в пробирки с разведениями антибиотика не позднее 30 мин с момента его приготовления.

Инкубация. Пробирки с тестируемыми штаммами, кроме пробирки "отрицательный контроль", инкубируются в обычной атмосфере при температуре 35^оС 20–24 ч. Пробирка "отрицательный контроль" помещается в холодильник (температура 4^оС), где хранится до учета результатов.

Учет результатов. Для определения наличия роста гемофильной палочки пробирки с посевами просматриваются в проходящем свете. Рост культуры в присутствии антибиотика сравнивается с референтной пробиркой ("отрицательный контроль"), содержащей исходный инокулюм и хранившейся в холодильнике. МПК определяется по наименьшей концентрации антибиотика, которая подавляет видимый рост H.influenzae.

Микрометод

В случае необходимости определения МПК у 8 и более штаммов целесообразно использовать микрометод. Он позволяет тестировать одновременно большое количество штаммов к нескольким антибиотикам.

Тестирование проводится в объеме 0,1 мл (0,05 мл НТМ бульона и 0,05 мл инокулюма), что позволяет значительно сократить количество расходного материала. Методика не имеет отличий от макрометода, за исключением объема, но требует дополнительного оснащения лаборатории многоканальными пипетками, микротитровальными плашками (с круглым или коническим дном) со стерильными крышками, специальным устройством с непрямой подсветкой для учета результатов.

Рост микрофлоры в присутствии антибиотика сравнивается с ростом культуры в ячейке без антибиотика.

Каждая партия тестируемых штаммов сопровождается внутренним контролем с использованием контрольных штаммов H.influenzae ATCC 49247 и E.coli ATCC 35218.

Метод Е-тестов

Е-тест представляет собой пластиковую полоску размером 5x50 мм c нанесенным градиентом концентрации антибиотика (0,002–32, 0,016–256 или 0,063–1024 мг/л в зависимости от препарата). Метод основан на диффузии антибиотиков в агар, что создает градиент концентрации антибиотика в агаре. Зона задержки роста имеет форму эллипса, размеры которого увеличиваются от меньшей концентрации антибиотика на полоске к большей.

Материалы:

1) НТМ агар, приготовленный в лаборатории, или коммерческие готовые чашки с агаром;

2) полоски Е-тестов с антибиотиками;

3) стерильный бульон Мюллера–Хинтона;

4) стандартные стерильные тампоны;

5) стандарт мутности 0,5 по МакФарланду.

Процедура приготовления НТМ агара и нанесения культуры аналогична таковой при диско-диффузионном методе. Поверхность микробного газона должна быть сухой, для чего Е-тесты наносят не ранее, чем через 15 мин от момента нанесения инокулюма. Полоски Е-тестов помещаются на поверхность агара пластиковой поверхностью с отметками градиента концентраций кверху. На чашку диаметром 90 мм наносят не более 2 полосок. Посевы инкубируют в течение 20–24 ч при температуре 35^оС в атмосфере с повышенным содержанием СО₂.

Учет результатов. Результаты следует учитывать только при наличии сплошного плотного газона культуры. Если рост слабый, необходимо продлить инкубацию. В случае "разреженного" роста газона тестирование нужно повторить, проверив качество агара и инокулюма. Результаты учитываются в отраженном свете и/или под лупой, чтобы хорошо рассмотреть край роста. Учитывается зона полного подавления роста. Величина МПК определяется тем значением концентрации, на уровне которой эллипс пересекается со шкалой полоски.

Интерпретация. Метод Е-тестов определяет МПК исходя из непрерывного градиента концентраций, включая значения между двукратными разведениями. Для определения категории чувствительности полученные значения следует округлять до ближайших значений двукратных разведений. Например:

1) для чувствительных штаммов значения МПК ампициллина Ј1 мг/л; методом Е-тестов получена МПК 0,064 мг/мл, результат интерпретируется как чувствительный;

2) МПК умеренно резистентных штаммов – 2 мг/л; методом Е-тестов определена МПК 1,5 мг/л, результат интерпретируется как умеренно резистентный.

Критерии интерпретации результатов определения чувствительности к некоторым антибиотикам методом разведений и Е-тестов приведены в табл. 8.

Таблица 8.

Критерии интерпретации чувствительности H.influenzae методом разведений и E-тестов

(NCCLS, 2000)

Антибиотик	МПК, мг/л
	Резистентный	Умеренно резистентный	Чувствительный
Ампициллин	4	2	1
Амоксициллин/клавуланат	4/2	–	2/1
Триметоприм/сульфаметоксазол	4	1	0,5
Цефтриаксон или цефотаксим, или цефтазидим	–*	–*	2
Меропенем или	–*	–*	0,5
Имипенем	–*	–*	4
Хлорамфеникол	8	4	2
Азитромицин или	–	–*	4
Кларитромицин	32	16	8
Тетрациклин	8	4	2
Ципрофлоксацин	–*	–*	1

* Резистентных штаммов не выделено.

Контроль качества. Используются штаммы H.influenzae ATCC 49247, H.influenzae ATCC 49766 (при тестировании карбапенемов) и E.coli ATCC 35218 (при тестировании ингибиторо-защищенных пенициллинов). Методика постановки и учета соответствует методике работы с испытуемым штаммом. Результаты интерпретируются по приведенным ниже критериям (табл. 9).

Таблица 9.