Данные ЯМР о структуре связанной воды в коллагене с помощью сканирующей калориметрии

В состав нативного (неповрежденного) коллагена входит связанная вода, составляющая около 2/3 (или ∼66%) от полной массы сухожилия. Установлено, что вода играет существенную роль в механизме самосборки молекул коллагена и образования фибрилл в цитоплазме коллагеноцитов, а также в механизмах биохимической активности и функционировании коллагена во внеклеточном пространстве живого организма [1]. Однако до настоящего времени принципиальный характер гидратной структуры коллагена остается невыясненным. По данным ²Н ЯМР спектроскопии сухожилий хвоста крысы, обогащенной тяжеловодородной водой ²H₂O, было установлено, что в ″плотных″ участках структуры коллагена молекулы связанной воды (²Н₂О) характеризуются константами квадрупольного взаимодействия (ККВ) ядер ²Н ~3 кГц (в интервале от +20° до ∼+5 °C).

При отрицательных температурах ККВ возрастают, достигая значений ~8 кГц при –10 °C, и тенденция к увеличению ККВ сохраняется при дальнейшем понижении температуры. Относительно малая величина ККВ и ее плавные изменения типичны для процессов диффузионной подвижности молекул воды в нанопористых системах цеолитового типа. Фазовые переходы в подобных системах, как правило, являются переходами типа порядок–беспорядок (близкими к фазовым переходам второго рода) и не сопровождаются резкими тепловыми эффектами.

В то же время по данным ²Н ЯМР водная подсистема коллагена в областях ″щелей″ характеризуется очень малыми значениями ККВ (близкими к нулевым), что указывает на сильную раз-упорядоченность подсистемы связанной воды в ″рыхлых″ участках структуры коллагена. Обнаружено также, что в окрестности температуры замерзания воды (∼273 K) скачкообразным образом изменяется спектр ²Н ЯМР сухожилия. Интенсивная центральная линия, относимая нами к рыхлым участкам структуры коллагена, становится ненаблюдаемой, что может указывать на фазовый переход первого рода. Данный факт косвенно свидетельствует в пользу модели, в соответствии с которой ″рыхлые″ участки структуры коллагена представляют собой тектогидрат, или структуру, включающую непрерывный трехмерный каркас из молекул воды с тетраэдрической координацией, характерной для льда и клатратных гидратов. В этом случае значение ККВ и ширина спектра ²Н ЯМР должны возрастать на два порядка по сравнению с комнатной температурой, соответственно амплитуда сигнала должна упасть на два порядка, что согласуется с экспериментом. Однако для прямого подтверждения подобной модели расположения молекул воды необходимо получить термодинамические характеристики данного фазового перехода.

В данной работе был проведен анализ величины скрытой теплоты фазового перехода в сухожилиях хвоста крысы с использованием метода сканирующей калориметрии. Для исследований были взяты образцы сухожилия RTT экспериментальных животных линии ″Вистар″, содержавшихся на стандартном питании. Возраст крыс составлял 6 месяцев, численность в группе – 3 животных. Образцы волокон сухожилий весом 100–150 мг изымали непосредственно перед исследованием. Измерения проводили в интервале от комнатной температуры (+20 °С) до –30 °С, скорость изменения температуры 3 град./мин. при использовании автоматического калориметра ДСК‑204 фирмы Netzsch (Германия). Результаты измерений представлены в таблице.

Полученные данные можно сравнить со справочными параметрами для скрытой теплоты плавления чистого льда: Q_пл(лед) = 333,5 Дж/г [6]. При сравнении следует учитывать, что в сухожилиях содержание коллагена достигает 94%, а содержание воды в нативном коллагене составляет ∼66%. Распределение связанной воды между плотными и рыхлыми участками достоверно не установлено, но по данным ЯМР ²Н [5] в ″рыхлых″ участках коллагена содержится примерно половина общего содержания воды в сухожилии. Таким образом, если структура подсистемы молекул воды в вакансионных участках нативного коллагена при отрицательных температурах соответствует структуре тектогидрата (клатратоподобного или льдоподобного типа), то ожидаемая скрытая теплота фазового перехода в данной подсистеме должна составить

Q_пер = ~(0,66⋅0,5⋅0,94)⋅Q_пл(лед) = ∼94 Дж/г,

что находится в хорошем согласии с измеренными значениями для трех образцов.

На кривых охлаждения наблюдаются пониженные значения Q_пер, что является следствием значительного переохлаждения образцов при понижении температуры. Данный эффект позволяет получить оценочное значение теплоемкости c_p высокотемпературной фазы подсистемы молекул воды, испытывающей фазовый переход. В рамках обсуждаемой модели среднее значение величины изменения теплоты фазового перехода ΔQ_пep = 16,55 ± 3,9 Дж/г должно быть связано со средней величиной температуры переохлаждения ΔТ = (11,5 ± 0,7)° соотношением

ΔQ_пep = ~(0,6⋅0,5⋅0,94)⋅Δс_рΔT,

где Δс_р – разность между теплоемкостью воды и льда. Если свойства водной подсистемы, испытывающей фазовый переход в коллагене, соответствуют свойствам свободной воды и льда, то Δс_р = 2,062 Дж/г (вблизи 0 °С [6]). Отсюда рассчитанная величина ΔQ_пер = ∼6,69 Дж/моль; пониженное по сравнению с экспериментом значение расчетной величины ΔQ_пер может указывать на существование вклада в Δс_р, связанного с взаимодействием молекул воды и функциональных группировок в белковой структуре. Таким образом, на качественном уровне величина скрытой теплоты фазового перехода находится в согласии с моделью, согласно которой свойства примерно половины связанной воды в структуре коллагена близки к свойствам свободной (или объемной) воды. Повышенные температура плавления льда связанной воды в коллагене и разница значений теплоемкости Δс_р могут указывать на некоторую взаимосогласованность структур воды и фибриллярного белка, возможно, клатратного типа.