Растворимые фракции и агрегация коллагена в фибриллы

После секреции в межклеточное пространство и отщепления, пропептидов молекулы коллагена агрегируют в фибриллы, являющиеся первичной формой надмолекулярной структуры коллагена. Поскольку молекулярный механизм фибриллообразования в Организме мало доступен для изучения, основные гипотезы получены на основании исследования агрегации молекул при осаждении их из растворов коллагена.

Типы растворимого коллагена можно разделить на две основные категории. К первой категории (нативные растворы) относятся растворимые фракции, получаемые прямой экстракцией из соединительной ткани молодых животных, у которых коллаген еще недостаточно скреплен межмолекулярными связями. Различаются кислоторастворимый и нейтральносолерастворимый коллаген, экстрагируемые соответственно кислыми буферами и нейтральными солевыми растворами. Ко второй категории относятся растворы зрелого, нерастворимого коллагена, полученные после предварительной ферментативной, химической или механической обработки ткани (солюбилизированный коллаген). Эта категория растворов была использована нами для создания лечебных препаратов из коллагена.

В зависимости от условий осаждения (рН, ионная сила, температура и др.) из раствора коллагена можно получить различные типы фибриллярных структур:

1) фибриллы с неупорядоченной структурой без периодичности;

2) кристаллы длиной 280 нм (SLS‑сегменты), представляющие собой параллельную агрегацию молекул бок в бок. В SLS определили 117 поперечных асимметричных полос, которые, подобно «отпечатку пальцев», характеризуют распределение полярных и неполярных аминокислотных остатков;

3) фибриллы FLS с периодом 280 нм, в которых молекулы также агрегируют параллельно, но ориентированы в соседних слоях в разные стороны (опозиционно), так что N‑концы соединены с С-концами; Рис. 27. Возможные пути внутриклеточного транспорта и секреции коллагена.

4) фибриллы нативного типа (т.е. соответствующие тканевым) с периодичностью 64–67 нм. Основной период в этих фибриллах состоит из светлой А-зоны и темной В-зоны, особенно отчетливо видимыми при негативной окраске фосфорно-вольфрамовой кислотой. После позитивного контрастирования в периоде обнаруживается 12 темных и 12 светлых дополнительных полос, отражающих первичную структуру молекулы [Kuhn К., 1974].

Для изучения фибриллогенеза в организме наибольшее значение имеет механизм агрегации молекул в фибриллы нативного типа, объясняющий наличие периодичности. Начиная с 50‑х годов был выдвинут ряд различных гипотез, из которых наибольшее значение имела модель сдвига соседних молекул на четверть своей длины [Schmitt F. О., Gross J., 1955], и модель R.A. Grant и соавт. (1967), по которой периодичность объясняется существованием на молекулах «полос связывания» длиной 26,5 нм, содержащими полярные группы, и полос, содержащих неполярные группы 37,5 нм.

Позже было установлено, что длина молекулы кратна не 4, а 4,4D (D – длина периода 64 нм). Молекулы, упакованные в фибриллу, в линейной проекции разделены промежутком 0,6 D (зона «пустоты»), а соседние параллельные ряды молекул сдвинуты относительно друг друга на величину периода D, причем они перекрывают концы параллельных им молекул на 0,4 D (зона «перекрытий»).

Таким образом, вдоль фибриллы чередуются зоны «пустот» и «перекрытий», которые на негативно окрашенных электронограммах отражаются соответственно в темных и светлых полосах периода [Ktihn К., 1969; BrunsR. R., Gross J., 1974; Miller A., 1976]. Вся структура стабилизована за счет поперечных связей между молекулами.

Описанная картина укладывается в двухмерную модель упаковки молекул коллагена, изучение же трехмерной структуры сопряжено со значительными трудностями. Одной из наиболее признанных является модель J.W. Smith (1968), по которой пять молекул, сдвинутых между собой на ID, соприкасаясь боковыми поверхностями, уложены в цилиндрический филамент, причем пятая молекула сдвинута по отношению к первой на 4D. Такой филамент растет в длину за счет присоединения новых молекул, а в ширину фибрилла растет только путем соединения филаментов между собой. Внутри филамента молекулы свернуты в спираль [Piez К.А., 1975]. Близка к этому и модель A. Veis н соавт. (1967), в которой предусматривается, что филаменты состоят из четырех молекул коллагена. Следует отметить, что диаметр филаментов по этим моделям (3,5 нм в сухом и 5 нм во влажном состоянии) совпадает с размерами минимальных филаментов (прото- или микрофибрилл), обнаруженных внутри тканевых коллагеновых фибрилл [Olsen В. R., 1963; Doyle В.В. et al., 1974; Brims R.R., 1976], а также в поперечно исчерченных филдментарных агрегатах (см. раздел 2.2.6).

По данным М. Bouteille, D. С. Pease (1971), J.H. Lillie и соавт. (1977), при «инертной» дегидратации, воздействии мочевины или гуанидинхлорида происходит диссоциация фибрилл на филаменты толщиной 3,5–4 нм, причем выявляется спиралевидное скручивание этих филаментов. Спиральная структура коллагеновых фибрилл обнаруживается также при применении метода замораживания – раскалывания [Rayns R. et al., 1974; Belton J. С. et al., 1975], вероятно, в результате использования агентов, разрушающих водородные связи. В некоторых случаях спиралевидная структура фибрилл отмечается и при обычной заливке, например в опухолях [Manabe Т., Kajikkawa V., 1976]. Подобные изменения были обнаружены в склере при резко выраженной близорукости.

В заключение следует отметить, что пока не существует общепризнанной модели трехмерной структуры фибриллы, которая полностью отвечала бы рентгеноструктурным и электронно-микроскопическим данным. Обсуждаются возможности тетрагональной и гексогональной решетки, цилиндрической (в форме вставленных друг в друга цилиндров из слоев молекул) и спиральной (закрученной в рулон) упаковки молекул в фибриллу [Miller A., 1976].