Молекулярная характеристика гена CAL (арабидопсис)

Ген арабидопсиса CAULIFLOWER очень похож на ген API, что и было использовано для его клонирования. Как и API, ген CAL тоже кодирует белок с доменом MADS, и, следовательно, тоже может являться активатором транскрипции. Последовательности белков Cal и Apl имеют гомологию 70 %. Внутри домена MADS они различаются только пятью аминокислотными остатками из 56, т. е. оба белка, вероятно, узнают похожие последовательности ДНК и участвуют в регуляции сходных генов. Таким образом, функциональная вырожденность этих генов, обнаруживаемая в генетических исследованиях, подтверждается их структурным сходством. Однако, хотя данные молекулярного анализа хорошо согласуются с фактом функциональной вырожденности генов CAL и API, они не дают ответа на вопрос, почему CAL может только частично заменять API.

Ген CAL начинает экспрессироваться в примордиях цветков одновременно с геном API, и затем тоже обнаруживается только в примордиях двух наружных мутовок органов. В отличие от API, РНК которого накапливается в больших количествах в процессе развития лепестков и чашелистиков, РНК CAL в примордиях этих органов обнаруживается лишь в небольших количествах. Возможно, именно поэтому CAL неспособен заменить API при формировании лепестков и чашелистиков. Какова же роль гена CAL в развитии цветка? Данные молекулярного анализа свидетельствуют о том, что в двойных мутантах apl cal концентрация РНК LFY очень сильно редуцирована, в то время как в мутантах apl она не отличается от таковой для дикого типа. Таким образом, функция CAL может заключаться в поддержании активности гена LFY. Вероятно, поэтому и фенотип тройных мутантов Ну apl cal не отличается от фенотипа двойных мутантов Ify apl: если ген LFY инактивирован, ген CAL уже неспособен влиять на его активность.

Соцветия цветной капусты Brassica oleracea var. botrytis и капусты-брокколи Brassica oleracea var. italica представляют собой одну из аномалий развития цветка. Как и многие другие разновидности используемой для еды капусты - такие, как капуста белокочанная и краснокочанная, брюссельская, листовая, - обе эти разновидности тоже произошли от Brassica oleracea дикого типа. Как известно, Brassica и арабидопсис относятся к одному семейству - крестоцветных, и их соцветия дикого типа и фенотипа cauliflower морфологически очень похожи. При исследовании двух достаточно отдаленных видов растений, арабидопсиса и львиного зева оказалось, что механизмы, контролирующие развитие цветка, у них довольно консервативны. Гомологи почти всех клонированных генов есть у обоих видов, и типы их экспрессии очень похожи. Следовательно, не должно быть сюрпризом то, что молекулярная основа фенотипа cauliflower у арабидопсиса и близкородственной Brassica oleracea var. botrytis могут быть идентичны. Чтобы проверить, так ли это на самом деле, были клонированы гомологи гена CAL - bobCAL из цветной капусты, boiCAL из брокколи и boCAL из Brassica oleracea дикого типа. Как оказалось, открытая рамка считывания гена bobCAL прерывается стоп-кодоном в пятом экзоне, и соответствующий мутантный белок имеет молекулярный вес 17 кДа вместо белка дикого типа с молекулярным весом 30 кДа. В гене boiCAL не обнаружили подобный стоп-кодон, однако, в нем имеется делеция кодонов пяти аминокислотных остатков, а также аминокислотные замены в двух из трех кодонах, которые изменены у мутанта арабидопсиса cal-1. Таким образом, эти данные свидетельствуют в пользу того, что фенотипы соцветий цветной капусты и брокколи по крайней мере частично обусловлены мутациями в гене CAL.

2.4 Молекулярная характеристика гена FIM (львиный зев)

Ген львиного зева FIM был клонирован с использованием метода транспозоновой мишени. Мутанты fun 619 и fim 620 с инсерцией мобильных элементов были получены в описанном выше эксперименте по мутагенезу. Ген арабидопсиса UFO был клонирован по гомологии с геном FIM: фрагмент гена FIM почти полной длины использовали как пробу для гибридизациии с геномной библиотекой арабидопсиса. Нуклеотидные последовательности генов FIM и UFO обладают значительной степенью гомологии. В то же время последовательности этих генов не обнаруживают значительного сходства с какими-либо другими нуклеотидными последовательностями, имеющимися в базах данных. Оба гена, FIM и UFO, активируются в молодых цветковых меристемах раньше генов типа органов цветка. Инициация их экспрессии наблюдается в центре цветковой меристемы, и затем эта область «расходится» в стороны и превращается в кольцо, в центре которого РНК FIM или UFO уже не обнаруживаются. Еще позднее экспрессия этих генов ограничивается небольшой областью между мутовками лепестков и других органов. UFO работает только в области между чашелистиками и лепестками, в то время как ген FIM экспресси-руется как между мутовками чашелистиков и лепестков, так и между мутовками лепестков и тычинок.

Между гомологами FIM/UFO, как и в случае другой пары FLO/LFY, обнаруживаются и другие различия. У цветков мутантов ufo, как и у мутантов Ify, образуются прицветники. Таким образом, одной из функций генов LFY и UFO является подавление образования прицветников. Подобной функцией не обладают их гомологи FLO и FIM. Ген UFO начинает действовать чуть раньше, чем ген FIM. Транскрипты UFO обнаруживаются на более ранней стадии, чем транскрипты FIM.

Мутации ufo выражаются в изменении размеров, количества и закладки органов цветка, а также в их слиянии. Это говорит о том, что ген UFO участвует в регуляции клеточных делений и пролиферации органов. Подтверждается это и фенотипом трансгенных растений арабидопсиса с геном UFO, слитым с конститутивным промотором p35S ВМЦК: в цветках таких растений развивается больше лепестков и тычинок, при этом общее количество лепестков и тычинок может быть как больше, так и меньше восьми, а количество репродуктивных органов может достигать шестнадцати (против шести в цветках дикого типа). Гены UFO/FIM характеризуются наличием F-бокса, который имеется также в генах, контролирующих синтез таких белков, как циклин А, циклин F и Cdc4, вовлеченных в контроль клеточного цикла у дрожжей. Некоторые белки с F-боксом, например MetSop и GRR1 дрожжей, функционируют как ингибиторы транскрипции. Белок Fim связывается с белками семейства Fap (от EIM-associated £roteins), которые очень напоминают белки Skpl дрожжей и человека. Последние образуют комплексы с белками, содержащими F-бокс, вызывая деградацию белков и развитие клеточного цикла. Ген FIM играет также ключевую роль в активации генов идентичности цветковой меристемы.

2.5 Молекулярная характеристика генов CEN (львиный зев) и TFL 1 (арабидопсис)

Гены CEN и TFL1 активируются в зрелых соцветиях дикого типа чуть ниже верхней части апикальной меристемы соцветия (рис. 3). РНК TFL1 также обнаруживается в латеральных генеративных меристемах и по всей длине генеративного стебля. Таким образом, вероятно, работа гена TFL1 в генеративном стебле приводит к задержке перехода к цветению. Ген CEN экспрессируется в генеративном стебле очень слабо. Вероятно, поэтому мутации сеп, в отличие от мутаций tfl, не влияют на время перехода к цветению. Экспрессия гена TFL1 в апикальной меристеме ингиби-рует работу в ней генов LFY и API, а гена CEN ингибирует экспрессию гена FLO и таким образом предотвращает развитие апекса побега как цветочной меристемы (рис. 11.34). Неожиданным результатом анализа взаимодействия CEN с другими генами оказалось то, что ген FLO в свою очередь необходим для экспрессии CEN в апикальной меристеме. В мутантных по FLO растениях, у которых формируется нефункциональная РНК FLO, РНК CEN не обнаруживается.

Рис. 3. Схематическое изображение начальных этапов развития генеративной меристемы мутанта сеп (а) и растений львиного зева дикого типа (б).

1 - момент закладки цветковых меристем; 2 и 3 - апекс генеративной меристемы через 2 и 6 дней с момента закладки цветковых меристем. Цветковые меристемы показаны черным цветом, вегетативные - белым, апикальные меристемы - точками. Прицветники не показаны. В мутанте cen ген FLO после некоторой задержки активируется в апикальной меристеме. В растениях дикого типа экспрессия FLO индуцирует экспрессию CEN. В субапикальной зоне (сигнал от FLO показан стрелками, зона экспрессии GEN заштрихована). Активация CEN ингибирует экспрессию FLO в апикальной меристеме.

Вывод

Гены, о которых говорилось выше, необходимы для успешного перехода к цветению. Можно выделить две группы таких генов: гены, влияющие на время индукции цветения, и гены идентичности цветковых меристем.