Папиллярные узоры пальцев рук - маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни...
Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим...
Топ:
Основы обеспечения единства измерений: Обеспечение единства измерений - деятельность метрологических служб, направленная на достижение...
Марксистская теория происхождения государства: По мнению Маркса и Энгельса, в основе развития общества, происходящих в нем изменений лежит...
Выпускная квалификационная работа: Основная часть ВКР, как правило, состоит из двух-трех глав, каждая из которых, в свою очередь...
Интересное:
Подходы к решению темы фильма: Существует три основных типа исторического фильма, имеющих между собой много общего...
Уполаживание и террасирование склонов: Если глубина оврага более 5 м необходимо устройство берм. Варианты использования оврагов для градостроительных целей...
Принципы управления денежными потоками: одним из методов контроля за состоянием денежной наличности является...
Дисциплины:
2018-01-13 | 321 |
5.00
из
|
Заказать работу |
|
|
Определение N-концевой аминокислоты в белке и последовательности аминокислот в олигопептидах
Фенилизотиоционат (ФИТЦ) - реагент, используемый для определения N-концевой аминокислоты в пептиде. Он способен реагировать с α-аминогруппой и α-карбоксильной группой свободных аминокислот, а также с N-концевой аминокислотой в пептидах (см. схему ниже).
В результате взаимодействия с N-концевой аминокислотой полипептида образуется фенил-тиогидантионовое производное, в котором дестабилизирована пептидная связь между α-карбоксильной группой N-концевой аминокислоты и α-аминогруппой второй аминокислоты в пептиде. Эта связь избирательно гидролизуется без повреждения других пептидных связей.
После реакции выделяют комплекс ФИТЦ-АК1, идентифицируют его хроматографическими методами. ФИТЦ можно использовать вновь с укороченным пептидом, полученным в предыдущем цикле, для определения следующей аминокислоты. Этот процесс ступенчатого расщепления пептида с N-конца был автоматизирован и реализован в приборе - секвенаторе, с помощью которого можно определять последовательность аминокислотных остатков в олигопептидах, состоящих из 10-20 аминокислот.
Многие полипептиды имеют первичную структуру, состоящую более чем из 100 аминокислот. Так как с помощью секвенаторов наиболее продуктивно определяют аминокислотную последовательность лишь небольших пептидов, молекулы полипептида расщепляют по специфическим местам на фрагменты.
Используя несколько разных расщепляющих агентов (ими могут быть ферменты или химические вещества) в разных пробах очищенного полипептида, можно получить частично перекрывающие друг друга фрагменты с установленной аминокислотной последовательностью. С их помощью можно воссоздать правильный порядок фрагментов и получить полную последовательность аминокислот в полипептидной цепи.
|
Ферментативное расщепление полипептида по специфическим участкам
Для специфического расщепления пептидных связей в белке можно использовать несколько разных ферментов. Наиболее широко используют ферментативный гидролиз полипептида протеолитическим ферментом - трипсином, который относят к группе пищеварительных ферментов (его вырабатывает поджелудочная железа). Фермент обладает высокой специфичностью действия. Он расщепляет пептидные связи, в образовании которых участвует карбоксильная группа остатков лизина или аргинина.
Исходя из установленного количества остатков лизина и аргинина, можно предсказать количество получаемых при гидролизе трипсином фрагментов. Так, если в полипептидной цепи 6 остатков аргинина и лизина, то при расщеплении трипсином можно получить 7 фрагментов. Затем в каждом фрагменте устанавливают аминокислотную последовательность.
Схема
Химическое расщепление полипептида по специфическим участкам
В некоторых случаях предпочтителен не ферментативный, а химический гидролиз. Так, реагент бромциан расщепляет только пептидные связи, в которых карбоксильная группа принадлежит остатку метионина. Зная количество остатков метионина в полипептидной цепи, легко установить количество получаемых фрагментов. Далее для каждого фрагмента в секвенаторе также устанавливают аминокислотную последовательность.
Получение аминокислотной последовательности полипептида с помощью перекрывающихся фрагментов
Для успешного установления последовательности полученных фрагментов полипептида необходимо получить пептиды с перекрывающимися аминокислотными последовательностями. Это достигают обработкой отдельных проб данного полипептида разными реагентами, расщепляющими белок в разных местах. Необходимо провести столько расщеплений, чтобы получить набор пептидов, обеспечивающих перекрывание всех участков, необходимых для определения последовательности исходного полипептида.
|
Рис. 4. Установление первичной структуры белка с помощью перекрывающихся пептидных фрагментов.
|
|
Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰)...
Состав сооружений: решетки и песколовки: Решетки – это первое устройство в схеме очистных сооружений. Они представляют...
Папиллярные узоры пальцев рук - маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни...
Индивидуальные и групповые автопоилки: для животных. Схемы и конструкции...
© cyberpedia.su 2017-2024 - Не является автором материалов. Исключительное право сохранено за автором текста.
Если вы не хотите, чтобы данный материал был у нас на сайте, перейдите по ссылке: Нарушение авторских прав. Мы поможем в написании вашей работы!