Вычисление спектра буферной емкости белка

Буферную емкость белка (β)на заданном участке значений рН можно вычислить по следующей формуле:

 

Спектр буферной емкости исследуемого вещества описывается дифференциальным уравнением вида:

Чем меньше величина приращения рН (ΔрН), тем ближе вычисленный спектр буферной емкости к теоретическому.

Рис. 4. Спектр буферной емкости (β,мкг-экв/мл) белкового раствора в интервале рН 2—12 (ΔрН = 0,2)

Экспериментальная часть

Выделение из крови оксигемоглобина по методу Д.Л.Драбкина с модификацией Л.А.Блюменфельда.

В опытах используют водно-солевые растворы оксигемоглобина в концентрации 5-10^-5 моль/л, который выделяют из эритроцитов путем их осмотического гемолиза.

Кровь, содержащую небольшое количество антикоагулянта (цитрат натрия или гепарин), смешивают с равным объемом изотонического (0,85%-го) раствора хлорида натрия. Смесь центрифугируют в течение 10 мин при 6000 об/мин на центрифуге ЦЛН-2. Надосадочную жидкость, содержащую плазму и тонкий слой лейкоцитов, осторожно удаляют пипеткой. К осадку, содержащему эритроциты, добавляют 0,85%-ый раствор NaCl до исходного объема, осторожно перемешивают и снова центрифугируют при тех же условиях.

К полученной отмытой эритроцитарной массе в качестве гемо-лизирующего агента добавляют дистиллированную воду. Гемолиз проводят в течение 3 мин при периодическом перемешивании. Мембраны эритроцитов осаждают центрифугированием в течение 15 мин при 8000 об/мин. Надосадочная жидкость содержит преимущественно раствор оксигемоглобина. Полученный раствор разбавляют до необходимой концентрации, которую определяют спектрофотометрически с использованием формулы:

где [НbО₂] — концентрация оксигемоглобина; D₅₇₆, D₅₆₀, D₅₄₀ — значения оптической плотности исследуемого раствора оксигемоглобина при длинах волн 576, 560 и 540 нм соответственно.

Опыт 1. Изучение буферных свойств растворов гемоглобина

Цель работы: исследовать буферные свойства молекул гемоглобина методом кислотно-основного титрования.

Задачи:

1) измерить общую буферную емкость раствора белка в интервале рН = 3,0-11,5;

2) определить количество титруемых ионогенных групп в заданных областях рН (3,0-5,0; 5,0-9,0; 9,0-11,5);

3) сравнить полученное число ионогенных групп с общим количеством групп, доступных для титрования при нормальных условиях, а также с общим числом способных к диссоциации групп в молекуле белка.

Материалы и оборудование: установка для регистрации кривых кислотно-основного титрования, секундомер, 0,2 М раствор хлорида калия, раствор оксигемоглобина в 0,2 М КС1, соляная кислота, гидроксид калия.

Ход работы

Приготовить водно-солевые растворы НbO₂ (с_б = 5-10^-5 моль/л) по методике, описанной выше. Подготовить установку для КОТ к работе:

а) включить и прогреть иономер в течение 30 мин;

б) настроить иономер по стандартным буферным растворам (рН = 4,01; 6,86; 9,18 при комнатной температуре);

в) установить требуемую скорость истечения титранта (100-300 мкл/мин);

г) прилить в ячейку с исследуемым раствором аликвоту соляной кислоты до его закисления до значения рН=1,5-2,0;

д) включить одновременно подачу титранта и секундомер. Через каждые 10-15 секунд регистрировать рН раствора. Титрование завершить при достижении рН=12,0.

Проведение опыта включает в себя два этапа:

1) титрование растворителя (КС1);

2) титрование раствора белка.

Каждый из этапов повторить не менее 3 раз. После каждого процесса титрования необходимо тщательно промывать электроды 2-4 порциями дистиллированной воды.

По результатам каждого титрования построить графики зависимости рН от количества прилитого титранта и определить графическим способом на кривой титрования величины ¹V₂ и ²V₂ (см. рис. 3) в выбранных областях рН. Результаты занести в таблицу 3.

По средним значениям ¹V₂ и ²V₂ вычислить для указанных интервалов рН буферную емкость раствора гемоглобина и количество титруемых ионогенных групп. Результаты занести в таблицу 4.

Таблица 3 – Результаты кислотно-основного титрования раствора гемоглобина

№ опыта	1V2 в интервале рН…, мкл	2V2 в интервале рН…, мкл
3,0-5,0	5,0-9,0	9,0-11,5	3,0-5,0	5,0-9,0	9,0-11,5
xср

 

Таблица 4 – Рассчитанные значения параметров, характеризующих буферные свойства гемоглобина

Показатель	ΔрН
3,0-5,0	5,0-9,0	9,0-11,5
Буферная емкость (β), мкг-экв/мкл
Число титруемых ионогенных групп (N)

На основании вычисленных β и N провести сравнительный анализ величин, отражающих число ионогенных групп, полученных экспериментально, с их общим количеством в молекуле белка.

Опыт 2. Изучение термоиндуцированных изменений в структуре молекулы белка методом кислотно-основного титрования

Цель работы: исследовать зависимость изменений структурных свойств гемоглобина от температуры в интервале 20-60⁰С.

Задачи:

1) измерить общую буферную емкость растворов нативного и термостатированного белка;

2) определить количество титруемых ионогенных групп в заданных областях рН (3,0-5,0; 5,0-9,0; 9,0-11,5);

3) сравнить полученное в опыте число ионогенных групп с общим количеством групп, доступных для титрования при нормальных условиях, а также с общим числом способных к диссоциации групп в молекуле белка.

Материалы и оборудование: установка для регистрации кривых кислотно-основного титрования, секундомер, раствор хлорида калия (0,2 моль/л), раствор оксигемоглобина в растворе КС1, соляная кислота, гидроксид калия, водяная баня.

Ход работы

Приготовить водно-солевые растворы НbО₂ (с_б = 5-10^-5 моль/л) по методике, описанной выше.

Опытные образцы растворов гемопротеида поместить на водяную баню и инкубировать в течение 20 мин при температуpax 20, 40, 50, 55, 60⁰С. Для каждого значения температуры опыт необходимо повторить в 2-3 повторностях (n).

Для достижения температурного равновесия термостатированные растворы белка выдержать при комнатной температуре в течение 15 мин.

Провести титрование (в двух-трех повторностях):

1) растворителя;

2) растворов нативного белка (контроль);

3) растворов термостатированного белка.

Провести статистическую обработку полученных данных и по средним значениям их величин вычислить:

а) буферную емкость растворов нативного и термостатированного гемоглобина;

б) по приведенным выше формулам — количество титруемых ионогенных групп;

в) полученные результаты занести в таблицу 5.

Таблица 5 – Рассчитанные значения параметров, характеризующих буферные свойства нативного и модифицированного прогреванием гемоглобина

Показатель	Температура прогревания	ΔрН
3,0-5,0	5,0-9,0	9,0-11,5
Буферная емкость (β), мкг-экв/мкл	контроль (до прогревания)
Число титруемых ионогенных групп (N)	контроль (до прогревания)

 

На основании вычисленных значений βи N провести анализ влияния прогревания гемоглобина при различных температурах на конформацию белка и его кислотно-основные свойства.

 

Опыт 3. Влияние некоторых химических агентов на буферную емкость белков

Цель работы: исследовать влияние различных химических соединений на буферные свойства гемоглобина методом кислотно-основного титрования.

Задачи:

1) измерить общую буферную емкость растворов нативного и химически измененного белка;

2) определить количество титруемых ионогенных групп в заданных областях рН (3,0-5,0; 5,0-9,0; 9,0-11,5);

3)сравнить полученное в опыте число ионогенных групп с общим количеством групп, доступных для титрования интактного белка, а также с общим числом способных к диссоциации групп в молекуле гемоглобина.

Материалы и оборудование: установка для регистрации кривых кислотно-основного титрования, секундомер, раствор хлорида калия (0,2 моль/л), раствор оксигемоглобина в растворе КС1, соляная кислота, гидроксид калия.

Ход работы

Приготовить:

а) водно-солевые растворы НbО₂ (с_б = 1∙10^-4 моль/л);

б) растворы химических реагентов в концентрациях, превышающих в два раза их конечные концентрации при модификации белка (например, 20%-й раствор этилового спирта). Перечень агентов и их концентрации дает преподаватель.

Методом половинного разведения приготовить рабочие растворы требуемых концентраций (например, с_б = 5∙10^-5 моль/л в 10%-м растворе этилового спирта).

Провести титрование (в двух-трех повторностях):

а) растворов нативного белка (контроль);

б) растворов модифицированного белка.

Провести статистическую обработку полученных данных и по средним значениям их величин вычислить:

а) буферную емкость растворов нативного и модифированного гемоглобина;

б) по приведенным выше формулам — количество титруемых ионогенных групп;

в) относительную буферную емкость опытных образцов в заданных областях рН (3,0-5,0; 5,0-9,0; 9,0-11,5);

г) полученные результаты занести в таблицу 6.

На основании вычисленных значений βи N провести анализ зависимости величины буферной емкости и числа титруемых ионогенных групп от типа действующего агента.

Таблица 6 – Рассчитанные значения параметров, характеризующих буферные свойства нативного и модифицированного различными химическими агентами гемоглобина

Показатель	Модифицирующий агент, его концентрация	ΔрН
3,0-5,0	5,0-9,0	9,0-11,5
Буферная емкость (β), мкг-экв/мкл	контроль (без модификации)
Число титруемых ионогенных групп (N)	контроль (без модификации)

 

На основании вычисленных значений βи N провести анализ влияния различных химических агентов на конформацию белка и его кислотно-основные свойства.

Контрольные вопросы

1. Белки. Структура и свойства (ионизация, поверхностный заряд, изоэлектрическая точка, конформационная чувствительность к рН, ионной силе и температуре раствора).

2. Гемоглобин — гемопротеин, его субъединичная структура и связи, стабилизирующие ее.

3. Понятие буферной емкости растворов. Какую информацию отражает величина буферной емкости?

4. Какие структуры белка обусловливают буферную емкость его растворов?

5. Перечислите ионогенные группы белковой молекулы, их рК и структуры, определяющие эту величину.

6. Объясните различие величин рК свободных аминокислот и связанных в полипептидную цепь аминокислотных остатков.

7. Охарактеризуйте понятия: «общая буферная емкость» и «относительная буферная емкость растворов».

9. Дайте определение понятию «ионная сила раствора», объясните его физико-химический смысл. Напишите уравнение для вычисления ионной силы раствора и проанализируйте его.

10. Принципы и методы, положенные в основу регистрации КОТ.

11. Охарактеризуйте зависимость между числом ионогенных групп и величиной буферной емкости.

12. Опишите механизмы, лежащие в основе действия ряда физико-химических факторов внешней среды (температуры, рН, химических веществ различной природы, УФ-радиации и других) на конформационное состояние белков.

 

Список рекомендуемой литературы

1. Степанов В. М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. — М.: Высшая школа, 1996. — С. 108—116.

2. Кнорре Д. Г., Крылова Л. Ф., Музыкантов В. С. Физическая химия. — М.: Высшая школа, 1990. — 416 с.

3. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот и др. — М.: Мир, 1991. — С. 20—40.

4. Ленский А. С. Введение в бионеорганическую и биофизическую химию. — М.: Высшая школа, 1989. — 256 с.

5. Якубис X. Д., Эшнайт X. Аминокислоты. Пептиды. Белки. — М.: Мир, — 1985. — С. 416—419.

6. Шульц Г., Ширмер Р. Принципы структурной организации белков. — М.: Мир, 1982. — 292 с.

7. Ленинджер А. Биохимия. М.: Мир, 1976. — 953 с.