М.Ю.Дубровин, И.А.Лундовских,А.А. Кытманов

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ВЯТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ

М.Ю.Дубровин, И.А.Лундовских,А.А. Кытманов

 

ПРАКТИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ

 

ПО БИОФИЗИЧЕСКОЙ ХИМИИ

 

 

Специальности «Биотехнология», «Микробиология».

 

Дисциплина «Биофизическая химия»

 

Киров, 2010

Оглавление

Общие требования к выполнению лабораторных работ
Тема 1. Кислотно-основные свойства биологических соединений
Лабораторная работа №1.1. Исследование структурных свойств белков методом кислотно-основного титрования на примере гемоглобина
Опыт 1. Изучение буферных свойств растворов гемоглобина
Опыт 2. Изучение термоиндуцированных изменений в структуре молекулы белка методом кислотно-основного титрования
Опыт 3. Влияние некоторых химических агентов на буферную емкость белков
Тема 2. Исследование оптических свойств биополимеров
Лабораторная работа №2.1. Исследование структурных свойств белков спектрофотометрическими методами
Опыт 1. Исследование влияния температуры на оптические свойства растворов оксигемоглобина
Опыт 2. Исследование спектральных характеристик оксигемоглобина человека, модифицированного солями свинца и кадмия
Опыт 3. Исследование структурно-функциональных свойств оксигемоглобина человека, модифицированного воздействием додецилсульфата натрия
Тема 3. Электрофорез
Лабораторная работа №3.1. Разделение белков сыворотки крови методом электрофореза
Опыт 1. Разделение белков сыворотки крови методом электофореза на бумаге
Опыт 2. Разделение белков сыворотки крови методом электрофореза на агарозном геле
Опыт 3. Разделение белков сыворотки крови методом электофореза на полиакриламидном геле
Лабораторная работа №3.2. Разделение изоферментов лактатдегидрогеназы методом электофореза в полиакриламидном геле
Тема 4. Хроматография
Лабораторная работа №4.1. Разделение белков методом гель-хроматографии
Лабораторная работа №4.2. Разделение белков методом ионообменной хроматографии
Опыт 1. Разделение белков сыворотки крови на ДЭАЭ-целлюлозе
Опыт 2. Разделение белков сыворотки крови на КМ-целлюлозе
Лабораторная работа №4.3. Исследование состава общих липидов методом тонкослойной хроматографии
Приложение 1. Форма протокола лабораторной работы

ТЕМА 1. КИСЛОТНО-ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА БИОЛОГИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ

Лабораторная работа №1.1

Исследование структурных свойств белков методом кислотно-основного титрования на примере гемоглобина

I. Физико-химические и буферные свойства гемоглобина

Аминокислоты, пептиды и белки, как и многие другие биологические соединения, обладают амфотерными свойствами, то есть могут вступать в химические реакции и как кислоты, и как основания. Почти все биологические процессы протекают в средах, очень стабильных в отношении концентрации водородных ионов, и часто изменяют свой ход (направление, скорость) при изменении рН.

Ионогенные группы белка

При изучении буферных свойств растворов белка получают важную информацию о структуре макромолекул. Для этого используют метод кислотно-основного титрования, который позволяет определить:

- число и тип диссоциирующих групп, их кажущиеся рК;

- тип взаимодействия ионогенных групп белка с лигандом;

- состояние групп, участвующих в формировании пространственной структуры биополимера;

- величину поверхностного заряда молекулы;

- наличие или отсутствие рН-зависимых конформационных состояний белковой молекулы;

- доступность для титранта функциональных групп аминокислотных остатков белка и др.

Перечень ионогенных групп аминокислот и соответствующие им значения рК приведены в табл. 2. При этом нужно учитывать, что значения рК этих групп могут несколько отличаться от приведенных в таблице вследствие их взаимодействия друг с другом.

Расчет числа связанных с аминокислотными остатками ионов Н⁺ для водорастворимых белков проводят по измеренным значениям рН, допуская, что изоионная молекула не влияет на ионную силу раствора, и коэффициент активности водородного иона является постоянной величиной.

Количество ассоциированных с аминокислотными остатками протонов определяется разностью между общим числом добавленных Н⁺-ионов (НС1) и числом свободных ионов водорода в растворе, которое оценивается потенциометрическим методом. При закислении раствора до значений рН=1,5 протонируется максимальное число ионогенных групп белка.

 

Таблица 2 - Ионогенные группы белка

Группа	рК	Аминокислота
α-карбоксильная	3,50	С-концевая
β-карбоксильная	3,86	Asp
γ-карбоксильная	3,86	Glu
имидазольная	6,04	His
α-аминная	8,03	N-концевая
сульфгидрильная	8,33	Cys
фенольная	10,07	Туг
ε-аминная	10,53	Lys
гуанидиновая	12,48	Arg

Из кислых реагентов для титрования белков обычно применяют соляную кислоту, а при титровании щелочью применяют гидроксид калия, диссоциация которых не вызывает значимых изменений в электролитном составе среды. Ионную силу раствора в процессе титрования поддерживают строго на заданном уровне, определяющем конформационное состояние белка.

Результаты измерений буферной емкости исследуемого раствора представляют в виде графиков зависимости изменения величины рН от количества прилитого титранта — кривых кислотно-основного титрования (КОТ) (рис. 3 на странице 14).

Т.Кеннан предложил разделять кривую титрования на следующие участки:

1. рН=1,5-5-6,0 (диссоциация карбоксильных групп);

2. рН=6,0-5-8,5 (диссоциация NН⁺-группы имидазольного кольца гистидина и концевых α-аминогрупп);

3. рН=8,5-5-11,5 (диссоциация сульфгидрильных групп цистеина, фенольных групп тирозина и ε-аминогрупп лизина); аргинин при титровании не определяется.

Титрование белковых растворов обычно проводят после их предварительного закисления до рН=1,5 или защелачивания до рН=11,5. В первом случае измеряют щелочную, а во втором — кислотную буферную емкость белка. Для этого, например, кислый раствор белка титруют щелочью (КОН) в интервале рН=1,5-11,5. С учетом полученных результатов титрования оценивают количество диссоциированных кислых (рН=1,5-7,0) и основных (рН=7,0-11,5) аминокислотных остатков в составе молекулы белка.

Количество ионогенных групп, определяемых экспериментально, обычно ниже числа ионизируемых аминокислотных остатков, входящих в состав белка, вследствие неодинаковой их доступности для титранта, обусловленной пространственной структурой макромолекулы. Максимальное приближение к теоретическим значениям буферной емкости достигается при денатурации белковой глобулы.

Расчет величин буферной емкости растворов белка в широком диапазоне рН (1,5-5-11,5) проводят с использованием интегральной кривой КОТ или выявляют характер распределения величин буферной емкости на отдельных участках этой кривой. В этом случае дифференциальная форма кривой (спектр буферной емкости) позволяет более детально анализировать структурные свойства белковой молекулы. Формируемые на кривой спектра буферной емкости пики соответствуют величинам рК различных ионогенных групп, к которым применим метод анализа спектральных кривых.

Экспериментальная часть

Выделение из крови оксигемоглобина по методу Д.Л.Драбкина с модификацией Л.А.Блюменфельда.

В опытах используют водно-солевые растворы оксигемоглобина в концентрации 5-10^-5 моль/л, который выделяют из эритроцитов путем их осмотического гемолиза.

Кровь, содержащую небольшое количество антикоагулянта (цитрат натрия или гепарин), смешивают с равным объемом изотонического (0,85%-го) раствора хлорида натрия. Смесь центрифугируют в течение 10 мин при 6000 об/мин на центрифуге ЦЛН-2. Надосадочную жидкость, содержащую плазму и тонкий слой лейкоцитов, осторожно удаляют пипеткой. К осадку, содержащему эритроциты, добавляют 0,85%-ый раствор NaCl до исходного объема, осторожно перемешивают и снова центрифугируют при тех же условиях.

К полученной отмытой эритроцитарной массе в качестве гемо-лизирующего агента добавляют дистиллированную воду. Гемолиз проводят в течение 3 мин при периодическом перемешивании. Мембраны эритроцитов осаждают центрифугированием в течение 15 мин при 8000 об/мин. Надосадочная жидкость содержит преимущественно раствор оксигемоглобина. Полученный раствор разбавляют до необходимой концентрации, которую определяют спектрофотометрически с использованием формулы:

где [НbО₂] — концентрация оксигемоглобина; D₅₇₆, D₅₆₀, D₅₄₀ — значения оптической плотности исследуемого раствора оксигемоглобина при длинах волн 576, 560 и 540 нм соответственно.

Опыт 1. Изучение буферных свойств растворов гемоглобина

Цель работы: исследовать буферные свойства молекул гемоглобина методом кислотно-основного титрования.

Задачи:

1) измерить общую буферную емкость раствора белка в интервале рН = 3,0-11,5;

2) определить количество титруемых ионогенных групп в заданных областях рН (3,0-5,0; 5,0-9,0; 9,0-11,5);

3) сравнить полученное число ионогенных групп с общим количеством групп, доступных для титрования при нормальных условиях, а также с общим числом способных к диссоциации групп в молекуле белка.

Материалы и оборудование: установка для регистрации кривых кислотно-основного титрования, секундомер, 0,2 М раствор хлорида калия, раствор оксигемоглобина в 0,2 М КС1, соляная кислота, гидроксид калия.

Ход работы

Приготовить водно-солевые растворы НbO₂ (с_б = 5-10^-5 моль/л) по методике, описанной выше. Подготовить установку для КОТ к работе:

а) включить и прогреть иономер в течение 30 мин;

б) настроить иономер по стандартным буферным растворам (рН = 4,01; 6,86; 9,18 при комнатной температуре);

в) установить требуемую скорость истечения титранта (100-300 мкл/мин);

г) прилить в ячейку с исследуемым раствором аликвоту соляной кислоты до его закисления до значения рН=1,5-2,0;

д) включить одновременно подачу титранта и секундомер. Через каждые 10-15 секунд регистрировать рН раствора. Титрование завершить при достижении рН=12,0.

Проведение опыта включает в себя два этапа:

1) титрование растворителя (КС1);

2) титрование раствора белка.

Каждый из этапов повторить не менее 3 раз. После каждого процесса титрования необходимо тщательно промывать электроды 2-4 порциями дистиллированной воды.

По результатам каждого титрования построить графики зависимости рН от количества прилитого титранта и определить графическим способом на кривой титрования величины ¹V₂ и ²V₂ (см. рис. 3) в выбранных областях рН. Результаты занести в таблицу 3.

По средним значениям ¹V₂ и ²V₂ вычислить для указанных интервалов рН буферную емкость раствора гемоглобина и количество титруемых ионогенных групп. Результаты занести в таблицу 4.

Таблица 3 – Результаты кислотно-основного титрования раствора гемоглобина

№ опыта	1V2 в интервале рН…, мкл	2V2 в интервале рН…, мкл
3,0-5,0	5,0-9,0	9,0-11,5	3,0-5,0	5,0-9,0	9,0-11,5
xср

 

Таблица 4 – Рассчитанные значения параметров, характеризующих буферные свойства гемоглобина

Показатель	ΔрН
3,0-5,0	5,0-9,0	9,0-11,5
Буферная емкость (β), мкг-экв/мкл
Число титруемых ионогенных групп (N)

На основании вычисленных β и N провести сравнительный анализ величин, отражающих число ионогенных групп, полученных экспериментально, с их общим количеством в молекуле белка.

Опыт 2. Изучение термоиндуцированных изменений в структуре молекулы белка методом кислотно-основного титрования

Цель работы: исследовать зависимость изменений структурных свойств гемоглобина от температуры в интервале 20-60⁰С.

Задачи:

1) измерить общую буферную емкость растворов нативного и термостатированного белка;

2) определить количество титруемых ионогенных групп в заданных областях рН (3,0-5,0; 5,0-9,0; 9,0-11,5);

3) сравнить полученное в опыте число ионогенных групп с общим количеством групп, доступных для титрования при нормальных условиях, а также с общим числом способных к диссоциации групп в молекуле белка.

Материалы и оборудование: установка для регистрации кривых кислотно-основного титрования, секундомер, раствор хлорида калия (0,2 моль/л), раствор оксигемоглобина в растворе КС1, соляная кислота, гидроксид калия, водяная баня.

Ход работы

Приготовить водно-солевые растворы НbО₂ (с_б = 5-10^-5 моль/л) по методике, описанной выше.

Опытные образцы растворов гемопротеида поместить на водяную баню и инкубировать в течение 20 мин при температуpax 20, 40, 50, 55, 60⁰С. Для каждого значения температуры опыт необходимо повторить в 2-3 повторностях (n).

Для достижения температурного равновесия термостатированные растворы белка выдержать при комнатной температуре в течение 15 мин.

Провести титрование (в двух-трех повторностях):

1) растворителя;

2) растворов нативного белка (контроль);

3) растворов термостатированного белка.

Провести статистическую обработку полученных данных и по средним значениям их величин вычислить:

а) буферную емкость растворов нативного и термостатированного гемоглобина;

б) по приведенным выше формулам — количество титруемых ионогенных групп;

в) полученные результаты занести в таблицу 5.

Таблица 5 – Рассчитанные значения параметров, характеризующих буферные свойства нативного и модифицированного прогреванием гемоглобина

Показатель	Температура прогревания	ΔрН
3,0-5,0	5,0-9,0	9,0-11,5
Буферная емкость (β), мкг-экв/мкл	контроль (до прогревания)
Число титруемых ионогенных групп (N)	контроль (до прогревания)

 

На основании вычисленных значений βи N провести анализ влияния прогревания гемоглобина при различных температурах на конформацию белка и его кислотно-основные свойства.

 

Опыт 3. Влияние некоторых химических агентов на буферную емкость белков

Цель работы: исследовать влияние различных химических соединений на буферные свойства гемоглобина методом кислотно-основного титрования.

Задачи:

1) измерить общую буферную емкость растворов нативного и химически измененного белка;

2) определить количество титруемых ионогенных групп в заданных областях рН (3,0-5,0; 5,0-9,0; 9,0-11,5);

3)сравнить полученное в опыте число ионогенных групп с общим количеством групп, доступных для титрования интактного белка, а также с общим числом способных к диссоциации групп в молекуле гемоглобина.

Материалы и оборудование: установка для регистрации кривых кислотно-основного титрования, секундомер, раствор хлорида калия (0,2 моль/л), раствор оксигемоглобина в растворе КС1, соляная кислота, гидроксид калия.

Ход работы

Приготовить:

а) водно-солевые растворы НbО₂ (с_б = 1∙10^-4 моль/л);

б) растворы химических реагентов в концентрациях, превышающих в два раза их конечные концентрации при модификации белка (например, 20%-й раствор этилового спирта). Перечень агентов и их концентрации дает преподаватель.

Методом половинного разведения приготовить рабочие растворы требуемых концентраций (например, с_б = 5∙10^-5 моль/л в 10%-м растворе этилового спирта).

Провести титрование (в двух-трех повторностях):

а) растворов нативного белка (контроль);

б) растворов модифицированного белка.

Провести статистическую обработку полученных данных и по средним значениям их величин вычислить:

а) буферную емкость растворов нативного и модифированного гемоглобина;

б) по приведенным выше формулам — количество титруемых ионогенных групп;

в) относительную буферную емкость опытных образцов в заданных областях рН (3,0-5,0; 5,0-9,0; 9,0-11,5);

г) полученные результаты занести в таблицу 6.

На основании вычисленных значений βи N провести анализ зависимости величины буферной емкости и числа титруемых ионогенных групп от типа действующего агента.

Таблица 6 – Рассчитанные значения параметров, характеризующих буферные свойства нативного и модифицированного различными химическими агентами гемоглобина

Показатель	Модифицирующий агент, его концентрация	ΔрН
3,0-5,0	5,0-9,0	9,0-11,5
Буферная емкость (β), мкг-экв/мкл	контроль (без модификации)
Число титруемых ионогенных групп (N)	контроль (без модификации)

 

На основании вычисленных значений βи N провести анализ влияния различных химических агентов на конформацию белка и его кислотно-основные свойства.

Контрольные вопросы

1. Белки. Структура и свойства (ионизация, поверхностный заряд, изоэлектрическая точка, конформационная чувствительность к рН, ионной силе и температуре раствора).

2. Гемоглобин — гемопротеин, его субъединичная структура и связи, стабилизирующие ее.

3. Понятие буферной емкости растворов. Какую информацию отражает величина буферной емкости?

4. Какие структуры белка обусловливают буферную емкость его растворов?

5. Перечислите ионогенные группы белковой молекулы, их рК и структуры, определяющие эту величину.

6. Объясните различие величин рК свободных аминокислот и связанных в полипептидную цепь аминокислотных остатков.

7. Охарактеризуйте понятия: «общая буферная емкость» и «относительная буферная емкость растворов».

9. Дайте определение понятию «ионная сила раствора», объясните его физико-химический смысл. Напишите уравнение для вычисления ионной силы раствора и проанализируйте его.

10. Принципы и методы, положенные в основу регистрации КОТ.

11. Охарактеризуйте зависимость между числом ионогенных групп и величиной буферной емкости.

12. Опишите механизмы, лежащие в основе действия ряда физико-химических факторов внешней среды (температуры, рН, химических веществ различной природы, УФ-радиации и других) на конформационное состояние белков.

 

Список рекомендуемой литературы

1. Степанов В. М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. — М.: Высшая школа, 1996. — С. 108—116.

2. Кнорре Д. Г., Крылова Л. Ф., Музыкантов В. С. Физическая химия. — М.: Высшая школа, 1990. — 416 с.

3. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот и др. — М.: Мир, 1991. — С. 20—40.

4. Ленский А. С. Введение в бионеорганическую и биофизическую химию. — М.: Высшая школа, 1989. — 256 с.

5. Якубис X. Д., Эшнайт X. Аминокислоты. Пептиды. Белки. — М.: Мир, — 1985. — С. 416—419.

6. Шульц Г., Ширмер Р. Принципы структурной организации белков. — М.: Мир, 1982. — 292 с.

7. Ленинджер А. Биохимия. М.: Мир, 1976. — 953 с.

 

БИОПОЛИМЕРОВ

Лабораторная работа №2.1

Исследование структурных свойств белков спектрофотометрическими методами

Спектрофотометрия

Способность молекул поглощать свет лежит в основе спектрофотометрии, широко используемой в биологии для качественного и количественного анализа и для выяснения химической структуры веществ. Поглощение света проявляется в ослаблении светового потока после прохождения через исследуемый объект, и оно тем больше, чем выше концентрация вещества (с, моль/л), толщина раствора (l, см) и способность вещества к поглощению. Для монохроматического света эти закономерности выражаются законом Бугера-Ламберта-Бера: если интенсивность падающего светового потока равна I₀, то интенсивность света после поглощения слоем вещества I будет равняться

I=I₀e^-εcl,

где ε (л/моль∙см) — молярный коэффициент экстинкции (поглощения).

Коэффициент экстинкции характеризует способность молекул вещества поглощать свет определенной длины волны и определяется структурными особенностями молекул данного вещества.

Регистрация абсолютного значения интенсивности света связана с большими погрешностями. Поэтому обычно используют относительные величины. Светопропускание (Т) – это выраженная в процентах величина, равная отношению интенсивности света, вышедшего из образца, к интенсивности света, падающего на него:

Т=I/I₀

В случае выполнения закона Бугера-Ламберта-Бера:

Т= e^-εcl

Таким образом, светопропускание связано с концентрацией вещества экспоненциальной зависимостью, что не очень удобно. Поэтому чаще используют величину, называемую оптическая плотность (D):

D= lgT = lgI/I₀= εcl

Если заменить десятичный логарифм на натуральный и концентрацию выражать в числе молекул в одном мл, то вместо ε используют поперечное сечение поглощения s (см²), связанное с ε соотношением: s = 3,8∙10^-21 ε. Физический смысл s – эффективное сечение молекулы, при попадании в которое происходит поглощение фотона данной длины волны.

Закон Бугера-Ламберта-Бера выведен для достаточно разбавленных растворов при использовании монохроматического света. При высоких концентрациях вещества регистрируемая оптическая плотность будет ниже теоретической, что объясняется экранированием молекул друг другом. Кроме того, значительные отклонения от закона могут быть обусловлены:

- свойствами анализируемого образца - способностью молекул вещества при больших концентрациях образовывать агрегаты, что приводит к росту светорассеяния и кажущемуся повышению его оптической плотности;

- конструкцией прибора - использование немонохроматического пучка света, работа в области, где высока погрешность прибора.

Графики, выражающие зависимость D, ε или s от длины волны, называют спектрами поглощения.

В биологии часто измеряют спектры поглощения не растворов, а мутных суспензий биологических частиц: эритроцитов, митохондрий, микроорганизмов. В таких оптически неоднородных средах наблюдается значительное светорассеивание и обусловленное этим кажущееся увеличение оптической плотности:

D _{измерения} =D _{поглощения} + D _{рассеяния}

На многих специально сконструированных для измерения мутных образцов спектрофотометрах поправка на D _{рассеяния} вводится автоматически. Чаще всего с этой целью кюветы помещают в интегрирующую сферу, собирающую рассеянный свет на фотоприемник.

Поглощение света осуществляется не всей молекулой, а определенными ее участками. Хромофоры - это отдельные группы атомов в молекуле вещества, поглощающие кванты света в УФ- и видимой областях спектра. Поглощение видимого и ультрафиолетового света происходит, главным образом с участием π и n-электронов (π→π* и n→ π*-переходы). Чем длиннее система сопряженных двойных связей в молекуле, то есть чем сильнее делокализованы по молекуле π-электроны, тем при большей длине волны располагается самый длинноволновый максимум поглощения (рис.7).

Простые белки (то есть состоящие только из полипептидной цепи и не содержащие простетической группы) в видимой области свет не поглощают. Основными их хромофорами в ультрафиолетовой области являются пептидные группы, ароматические аминокислоты (тирозин, триптофан, фенилаланин) с максимумом поглощения между 275 и 285 нм и цистеин. Из всех ароматических аминокислот наиболее значительным поглощением обладает триптофан. Знание молярных коэффициентов поглощения для разных белков оказывается полезным при фотометрическом определении их концентрации в растворе.

Хромофоры нуклеиновых кислот - пуриновые и пиримидиновые азотистые основания (аденин, гуанин, тимин, цитозин и урацил) - также поглощают свет только в УФ-области.

 

Рис.7. Спектры поглощения и флюоресценции некоторых биологически важных соединений (структурные формулы хромофоров этих молекул приведены рядом со спектрами).

Сплошные кривые – оптическая плотность; пунктирные кривые – интенсивность флюоресценции.

Хромофорами гемопротеинов в видимой области является гем. Так, благодаря железопорфирину в составе гембелка, раствор оксигемоглобина обнаруживает несколько максимумов поглощения в этой области спектра: самый значительный (интенсивный) в области 412-414 нм (полоса Соре) и максимумы меньшей интенсивности при 542 и 578 нм.

 

С помощью спектральных методов, измеряя оптическую плотность, можно получить следующую информацию:

- рассчитать концентрацию вещества в растворе (используя линейную зависимость оптической плотности от концентрации или по калибровочной прямой) - этот метод часто используют для определения концентрации различных белков, липидов, витаминов, для расчета активности ферментов;

- построить спектр поглощения вещества (зависимость его оптической плотности от длины волны). Спектр поглощения является характеристикой вещества, таким образом, по спектру поглощения можно определить, какое вещество (или класс веществ) находится в растворе;

- изменение структуры биополимеров отражается на их спектрах, следовательно, анализируя спектр поглощения, можно делать выводы о структурном состоянии биомолекул.

Спектральные приборы

Спектрофотометрический метод, то есть изучение оптических характеристик биологических веществ, построение спектров их поглощения - один из наиболее распространенных методов исследования в биологии.

В биологических исследованиях чаще всего используются спектрофотометры (СФ) и фотоэлектроколориметры (ФЭК). Для выделения участка спектра или отдельных длин волн в фотоколориметрах используют, как правило, светофильтры; в спектрофотометрах свет разлагается в спектр с помощью призмы или дифракционной решетки, а затем на объект направляется луч света определенной длины волны. Кроме того, в спектрофотометрах существенно шире рабочая область длин волн света (фотоэлектроколориметры обычно работают только в видимой области). Для этой цели, как правило, в спектрофотометрах имеется два различных источника света и часто два фотоэлемента или других регистрирующих свет устройства.

Принципиальная схема (рис. 8) современных фотоэлектроколориметров включает в себя следующие блоки:

1) источник света, дающий излучение в видимой области спектра - лампа накаливания;

2) оптическая система;

3) светофильтр;

4) кюветное отделение;

5) фотоэлемент (чаще всего используется селеновый фотоэлемент), преобразующий энергию светового потока в электрическую энергию;

6) блок усилителя фототока;

7) регистрирующее устройство (высокочувствительный микроамперметр или цифровой вольтметр; в современных ФЭК - вычислительный блок с микропроцессорной системой).

Блок-схема спектрофотометра принципиально отличается тем, что вместо светофильтра в этих приборах используется монохроматор (призма или дифракционная решетка).

Рис. 8. Блок-схема фотоэлектроколориметра.

Принцип действия колориметров основан на измерении светопропускания или оптической плотности исследуемого образца относительно контрольного раствора. При этом оптическую плотность контроля принимают равной нулю. Контроль, а затем опытный образец поочередно устанавливают на пути светового потока. Световые потоки фотоприемниками преобразуются в электрические сигналы.

Правила работы на фотоколориметре KF-77 следующие:

В кюветное отделение ставят кюветы с контрольным и исследуемым растворами. Каретка с кюветами должна находиться в среднем положении, при котором световой поток оказывается перекрытым. Устанавливают нужный светофильтр (указанная на оправе светофильтра длина волны должна находиться вверху). Сдвигают каретку с установленными кюветами таким образом, чтобы на пути светового луча оказалась кювета с контрольным раствором. Стрелка измерительного прибора выводится на ноль оптической плотности (100% поглощения) с помощью ручек грубой и тонкой настройки, расположенных под шкалой. Затем каретку с установленными кюветами сдвигают таким образом, чтобы ввести в световой поток кювету с исследуемым раствором, и снимают отсчет по шкале оптической плотности или светопропускания.

Понятие о ксенобиотиках

Одна из центральных проблем современной биологии — изучение молекулярных механизмов действия физико-химических факторов на биосистемы различного уровня организации. Актуальность этой проблемы в настоящее время связана, в первую очередь, с развитием глобальных экологических катастроф, являющихся следствием производственной деятельности человека. К ним следует отнести антропогенную токсикацию планеты, обусловленную попаданием в окружающую среду и накоплением в живых организмах целого ряда неорганических и органических соединений. Ответная реакция целостного организма на воздействие того или иного экологического фактора является отражением структурно-функциональных изменений биологических макромолекул и их надмолекулярных комплексов под влиянием химических и физических агентов в клетке. Кроме того, экологический мониторинг невозможен без использования современных биофизических и биохимических методов анализа состояния биологических систем, характеризующихся высокой чувствительностью, точностью, быстродействием, позволяющих исследовать биопроцессы без нарушения живых структур в отдельных клетках, тканях и организме.

К ксенобиотикам (веществам, чужеродным для организма) относят продукты хозяйственной деятельности человека (промышленности, сельского хозяйства, транспорта), вещества бытовой химии (в т.ч. моющие средства), большинство лекарственных соединений.

Все ксенобиотики в той или иной мере токсичны для организмов. очень сложна. Для количественной оценки токсичности веществ определяют дозу токсина на один кг живого веса (массы) объекта, приводящую к 100%- или 50%-ой гибели организмов (соответственно ЛД₁₀₀ или ЛД₅₀). При получении дозы, меньше летальной, происходит выведение токсинов и продуктов их превращений из организма, характеризуемое временем полувыведения — t_0,5 (варьирует от нескольких часов до нескольких десятков лет). Важными характеристиками токсинов являются также время 100%- или 50%-ой гибели объектов и способность разных ксенобиотиков распределяться в различных тканях и органах.

В организме токсины подвергаются ферментативным химическим превращениям, в результате которых может происходить как их дезактивация (детоксикация), так и усиление токсичности. В процессах метаболизма ксенобиотиков (в частности, лекарственных веществ) осуществляется их модификация (освобождение функциональных групп) и конъюгация (присоединение функциональных групп или молекул). Они протекают с участием системы цитохрома Р₄₅₀, локализованной в мембранах эндоплазматической сети, а также глутатионтрансфераз гиалоплазмы. В последующих процессах связывания, транспорта и выведения ксенобиотиков участвуют альбумин и липопротеины сыворотки крови, глутатион-трансферазы клеток печени, металлотионеин, Р-гликопротеин, обладающий свойствами транспортной АТФазы.

К неорганическим токсинам относят, прежде всего, тяжелые металлы: ртуть, свинец, кадмий, кобальт, никель, цинк, олово, медь, молибден, мышьяк и другие. Они способны поступать в организм человека через легкие, слизистые оболочки, кожу, желудочно-кишечный тракт. Характер распределения и степень накопления тяжелых металлов в органах и тканях зависит от их химического сродства к биомакромолекулам, прочности образуемых комплексов и скорости их элиминации. Так, свинец концентрируется в костях скелета, кадмий — в почках и легких. В клетках некоторые металлы накапливаются преимущественно в ядрах (ртуть, свинец, никель, цинк), кадмий — в цитоплазме, марганец — в митохондриях. Они способны вступать во взаимодействие со свободными аминокислотами, белками (за счет карбоксильных, амино- и SH-групп, имидазольной группы гистидина), нуклеиновыми кислотами, органическими кислотами, фосфатами. В результате происходит нарушение структурного состояния и функциональной активности биополимеров и их комплексов, клеток и, как следствие, целого организма, его органов и систем.

Установлено, что как при однократном, так и при хроническом действии различных тяжелых металлов на организм в сыворотке крови увеличивается активность растворимых ферментов цитозоля: аланин- и аспартатаминотрансфераз, лактатдегидрогеназы, альдолазы, что связано с изменением проницаемости плазматической мембраны и выходом молекул белков из клетки. Повышение активности было отмечено и при исследовании уровня лизосомальных ферментов: β-галактозидазы и β-глюкуронидазы, а также кислой фосфатазы крови. Снижение функциональной активности наблюдали при изучении щелочной фосфатазы сыворотки крови и ферментов пероксисом (каталазы, пероксидазы) в крови и тканях. Ингибирование митохондриальных ферментов (сукцинатдегидрогеназы, цитохромоксидазы, АТФазы) при воздействии соединений ртути в опытах in vitro и in vivo обусловлено, по-видимому, блокированием SH-групп белков.

Тяжелые металлы выступают в роли ингибиторов монооксигеназных систем эндоплазматического ретикулума (цитохрома Р₄₅₀), участвующих в метаболизме ксенобиотиков. Их токсическое действие на организмы связано и с нарушением обмена кальция, который выступает в роли универсального вторичного посредника (мессенджера) растительных и животных клеток. Определение содержания кальция в клетке используют как тест на цитотоксическое действие тяжелых металлов, так как избыточное его содержание является следствием реце