История создания датчика движения: Первый прибор для обнаружения движения был изобретен немецким физиком Генрихом Герцем...
Автоматическое растормаживание колес: Тормозные устройства колес предназначены для уменьшения длины пробега и улучшения маневрирования ВС при...
Топ:
Характеристика АТП и сварочно-жестяницкого участка: Транспорт в настоящее время является одной из важнейших отраслей народного хозяйства...
Устройство и оснащение процедурного кабинета: Решающая роль в обеспечении правильного лечения пациентов отводится процедурной медсестре...
Комплексной системы оценки состояния охраны труда на производственном объекте (КСОТ-П): Цели и задачи Комплексной системы оценки состояния охраны труда и определению факторов рисков по охране труда...
Интересное:
Распространение рака на другие отдаленные от желудка органы: Характерных симптомов рака желудка не существует. Выраженные симптомы появляются, когда опухоль...
Что нужно делать при лейкемии: Прежде всего, необходимо выяснить, не страдаете ли вы каким-либо душевным недугом...
Влияние предпринимательской среды на эффективное функционирование предприятия: Предпринимательская среда – это совокупность внешних и внутренних факторов, оказывающих влияние на функционирование фирмы...
Дисциплины:
2018-01-29 | 842 |
5.00
из
|
Заказать работу |
|
|
Состав: 25 мМтрис, 192 мМ глицин, 0.1% SDS, деионизированная вода.
Для приготовления электрофорезного буфера развести в десять раз трис-глициновый стоковый раствор в мерной колбе и добавить SDS до конечной концентрации 0.1%. Довести деионизированной водой до требуемого объема.
Лабораторная пропись для получения 1л раствора: 100 мл трис-глицинового стокового раствора 10Х, 10 мл 10%-ногоSDS, деионизированная вода.
Разделяющий гель:
Состав: 62.5 мМтрис-НСl, рН 8.8, 46.5% бис-акриламид (30%, 29:1), 0.1% SDS, 0.5% персульфата аммония, 0.09% TEMED, деионизированная вода.
Способ приготовления: Смешать все компоненты геля в указанном количестве
Лабораторная пропись для получения 1 геля: 0.74 мл деионизированной воды, 1.50 мл 1М трис-НСl, рН 8.8, 2.00 мл раствора бис-акриламида (30%, 29:1), 40 мкл 10%-ного раствора SDS, 20 мкл 10%-ного раствора персульфата аммония, 4 мклTEMED.
Формирующий (концентрирующий) гель:
Состав: 62.5 мМтрис-НСl, рН 6.8, 26.85% бис-акриламид (30%), 0.1 % SDS, 0.94% персульфата аммония, 0.2% TEMED, деионизированная вода.
Способ приготовления: Смешать все компоненты геля в указанном количестве
Лабораторная пропись для получения 1 геля: 0.8 мл деионизированной воды, 0.25 мл 1М Трис-НСl, рН 6.8, 0.4 мл раствора бис-акриламида (30%, 29:1), 20 мкл 10%-ного раствора SDS, 14 мкл 10%-ного раствора APS, 3 мклTEMED
2.4. Ход работы:
Для выполнения данной лабораторной работы рекомендуется использовать гребенки с 10 ячейками и спейсеры толщиной 0.75 мм. Ширина каждой ячейки – 6.5 мм. Максимальный объем образца – 30 мкл.
1. В качестве подготовки к лабораторной работе стеклянные пластины промывают мягким детергентом, ополаскивают достаточным объемом деионизированной воды и спирта, затем высушивают в вертикальном положении.
|
2. Рамку для заливки геля ставят в вертикальное положение зажимами вперед в открытом положении, затем собирают форму для геля – одно стекло – с приклеенным спейсером, второе – укороченное.
3. Форму берут таким образом, чтобы метки («up») на стекле со спейсером находились вверху и укороченное стекло ‑ спереди, и устанавливают в рамку для заливки геля. Следует убедиться, что нижние края обоих стекол находятся на одном уровне, после чего необходимо зафиксировать форму зажимами.
4. Собранную рамку устанавливают в стенд для заливки геля стеклянной формой вперед: упираясь нижним краем стекол в резиновую прокладку, подводят верхний край стекол под выступ на клипсе.
5. Затем вставляют гребенки между стекол: надписями вперед, пока выступ на гребенке не упрется в укороченное стекло. От дна ячеек отмеряют 1 см и отмечают это положение фломастером. Удаляют гребенку.
6. До этого уровня будет заливать разделяющий гель. После заливки разделяющего геля поверх него наслаивают 96% этиловый спирт (или деионизированную воду). Как только разделяющий гель заполимеризовался (это занимает примерно полчаса), спирт тщательно удаляют при помощи фильтровальной бумаги.
7. Заливают формирующий гель и устанавливают гребенку. Дают гелю полимеризоваться (это занимает примерно полчаса), и достают рамку из стенда для заливки геля.
8. Повернув защелки вперед извлекают кассету с гелем и вставляют в щели на дне электродной ячейки (укороченное стекло смотрит внутрь) и прижимают к зеленой прокладке. Следует убедиться, что укороченное стекло попадает в углубления на зеленой прокладке.
9. Вставляют кассеты с гелем и электродную ячейку в фиксирующую рамку. Надавливая сверху на электродную ячейку, защелкивают оба зажима на фиксирующей рамке, и опускают фиксирующую рамку в мини-резервуар.
10. Внутреннюю камеру заполняют трис-глициновым электродным буферным раствором, так чтобы его уровень располагался между верхними краями укороченного стекла и стекла со спейсером (для этого необходимо примерно 125 мл буфера) и добавляют примерно 200 мл трис-глицинового буфера в мини-резервуар.
|
11. Готовим образцы для электрофореза.
Приготовление образцов из телец включения, клеточной биомассы, нерастворимой фракции:
Центрифугируют 100мкл образца при 7000g в течении 10мин, тщательно удаляют полностью супернатант, затем добавляют к пробе 100мкл горячего буфера TES и прогревают образец в течение 5 мин при 99 0С. После чего добавляют к пробе 100мкл буфера Лэммли и снова прогревают образцы 5мин при 990С.
Приготовление растворимых белковых образцов:
Отбирают 100 мкл образца и добавляют к нему 100 мкл буфера Лэммли. Прогревают образцы в течение 5 мин при 99 0С.
Маркер молекулярных весов поставляется уже в готовом состоянии. Его необходимо только прогреть в течение 5 мин при 99 0С.
12. Наносят образцы в ячейки геля при помощи мини-шприца Гамильтона или дозатора с тонким носиком.
13. Электрофорез проводят при постоянном напряжении 200 Вольт. Время электрофореза - примерно один час.
14. По окончании электрофореза отсоединяют ячейку Mini-Protean III от источника напряжения. Снимают крышку и осторожно достают фиксирующую рамку с электродной ячейкой и кассетами для геля, после чего сливают электрофорезный буферный раствор, открывают защелки фиксирующей рамки и достают электродную ячейку с кассетами для гелей.
15. Специальным шпателем разъединяют стеклянную форму для геля. Гель погружают в фиксирующий раствор (10%-ная уксусная кислота) и, осторожно покачивая, отсоединяют его от стекла.
16. Фиксируют гель в течение 30 мин при постоянном покачивании. После чего заливают его окрашивающим раствором. Для ускорения процесса окрашивания можно подогреть окрашивающий раствор вместе с гелем в микроволновой печи.
17. Когда интенсивность полос на геле перестает меняться, окрашивающий раствор необходимо слить, а гель промыть раствором 10%-ой уксусной кислоты. Раствор для отмывки также можно подогреть вместе с гелем в микроволновой печи. Это существенно ускоряет процесс отмывки.
18. Результаты электрофореза визуально анализируют по электрофореграмме, путем сравнения со стандартными образцами и маркером молекулярных весов.
Вопросы для самоконтроля
1. Какое свойство белковых молекул позволяет им образовывать отдельные зоны на электрофореграмме? От каких условий это свойство зависит и может изменяться?
|
2. Что такое суммарный заряд белковой молекулы? Почему он изменяется при изменении рН окружающей среды? Что такое pI?
3. Как будет изменяться суммарный заряд белковых молекул при проведении электрофореза в нативных и денатурирующих (SDS) условиях?
4. Подумайте, почему не следует выбирать электродные буферные растворы со значением рН, сильно (более чем на 4 ед) отличающимся от рI разделяемых белков?
5. Напишите структурную формулу полиакриламидного геля. Почему ПААГ считается лучшим носителем жидкой фазы?
6. Для чего при приготовлении геля используют следующие компоненты: персульфат аммония, акриламид, N,N′-метиленбисакриламид, додецилсульфат натрия, трис?
7. Для чего при приготовлении буфера Лэммли используют следующие компоненты: трис, β-меркаптоэтанол, додецилсульфат натрия, глицерин, метиленовый синий?
8. Подумайте, как можно повысить разрешающую способность электрофореза для более эффективного разделения препарата, состоящего из белков со следующими значениями молекулярной массы: 10 кДа, 18 кДа, 30 кДа, 32 кДа, 36 кДа, 48 кДа, 79 кДа, 112 кДа, 220 кДа.
Список литературы
1. «Protein electrophoresis», GE Healthcare Biosciences resources (http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/ru/GELifeSciences/applications/electrophoresis/);
2. U. K. Laemmli. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature, 227, 680-685.
3. H. Schagger, G. von Jagow. 1987. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa// Anal. Biochem., 166, 368-379.
4. Э. Гааль, Г. Медбеши, Л. Верецкеи Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир, 1982. – 448 с.
5. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике (в 2-х томах). Минск, 2000. – 463 с.
6. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука, 1981. – 288 с.
7. Д. Нельсон, М. Кокс. Основы биохимии Ленинджера. Том 1. М.: Бином, 2012. – 696 стр.
8. К. Уилсон, Д. Уолкер. Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии. М.: Бином. Лаборатория знаний, 2013. – 848 с.
9. П. Ригетти. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение. М.: Мир.1986. – 399 с.
[1]https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsr/research-and-discovery/products-and-services/capillary-electrophoresis/pa-800-plus-pharmaceutical-analysis-system/index.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/A66527///0/1//0/
[2] J. F. Sambrook and D. W. Russell, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, 2100 pp
[3] Р. Скоупс. Методы очистки белков. М., «Мир».1985. – 358 с.
|
|
Археология об основании Рима: Новые раскопки проясняют и такой острый дискуссионный вопрос, как дата самого возникновения Рима...
Двойное оплодотворение у цветковых растений: Оплодотворение - это процесс слияния мужской и женской половых клеток с образованием зиготы...
Состав сооружений: решетки и песколовки: Решетки – это первое устройство в схеме очистных сооружений. Они представляют...
Архитектура электронного правительства: Единая архитектура – это методологический подход при создании системы управления государства, который строится...
© cyberpedia.su 2017-2024 - Не является автором материалов. Исключительное право сохранено за автором текста.
Если вы не хотите, чтобы данный материал был у нас на сайте, перейдите по ссылке: Нарушение авторских прав. Мы поможем в написании вашей работы!