История развития хранилищ для нефти: Первые склады нефти появились в XVII веке. Они представляли собой землянные ямы-амбара глубиной 4…5 м...
Наброски и зарисовки растений, плодов, цветов: Освоить конструктивное построение структуры дерева через зарисовки отдельных деревьев, группы деревьев...
Топ:
Характеристика АТП и сварочно-жестяницкого участка: Транспорт в настоящее время является одной из важнейших отраслей народного...
Процедура выполнения команд. Рабочий цикл процессора: Функционирование процессора в основном состоит из повторяющихся рабочих циклов, каждый из которых соответствует...
Когда производится ограждение поезда, остановившегося на перегоне: Во всех случаях немедленно должно быть ограждено место препятствия для движения поездов на смежном пути двухпутного...
Интересное:
Лечение прогрессирующих форм рака: Одним из наиболее важных достижений экспериментальной химиотерапии опухолей, начатой в 60-х и реализованной в 70-х годах, является...
Средства для ингаляционного наркоза: Наркоз наступает в результате вдыхания (ингаляции) средств, которое осуществляют или с помощью маски...
Инженерная защита территорий, зданий и сооружений от опасных геологических процессов: Изучение оползневых явлений, оценка устойчивости склонов и проектирование противооползневых сооружений — актуальнейшие задачи, стоящие перед отечественными...
Дисциплины:
2017-12-12 | 218 |
5.00
из
|
Заказать работу |
|
|
Белки – самый сложный БП на сегодня. Заряд не коррелирует с длиной и может сильно варьировать.
Изоэлектрическая точка – рН, при котором суммарный заряд равен 0.
Полезный параметр разделения
Использование исчерпывающей денатурации приводит к нормализации заряда.
Проводится взаимодействием с избытком денатурирующих агентов, детергентов типа SDS.
После денатурации белок напоминает НК: его заряд становится в некотором роде пропорциональным массе.
DISC электрофорез
на примере электрофореза белков в присутствии SDS по U. Laemmli
(модифицированная система буферов Орнштейна и Девиса)
Состоит из двух совершенно разных совмещенных систем.
Э/ф по Лэммли – самый цитируемый на сегодня. Хотя он самой системы не сделал, а просто предложил вести в денатурирующих условиях.
Препараты содержат очень много примесей, в т.ч. ионогенных и примесей других белков, и имеют большой объем.
Очищать их трудно и нежелательно
Был запрос – сделать систему, в которой бы сначала велось концентрирование проб. А непосредственное разделение никого не устраивали. Если объем большой, то ширина зоны изначально очень большая, и ионогенные примеси ее расширяют и искажают.
Давайте используем изотахофорез, каждый БП сконцентрируем в своей зоне. Добьемся такой концентрации, что от наличия ионогенных примесей уже не будет зависеть, и форма зоны будет идеальной.
А потом эти зоны нанесем на э/ф, на фоне однородного электролита.
А почему нас не усраивал изотахофорез? Зоны слишком плотно прилегают друг к другу, не разойдутся. Детектировать плохо, извлекать плохо.
Glycine: NH -CH -COOH,
pKa =2.34, pKa =9.6, pI=5.97
|
1 этап. Концентрирующий гель.
По сути нам не нужен, используется только для подавления конвекции.
Гель кА можно более низкой процентности.
Можно даже агарозный, но проблема с нагревм
Чаще ПААГ.
Лидирующий и замыкающий анион – 2 буфера
Для лидирующего используем хлор
С замыкающим проблема. Причем при переходе в другой гель замыкающий анион должен неожиданно увеличить подвижность и обогнать все разделяемые компоненты и убежать далеко вперед, чтобы э/ф шел на фоне этого замыкающего аниона
Делаем это просто, засчет изменения рН.
Используются глицин, например.
Пусть будет в геле рН 6.8.
Если рН сдвинем в кислую область и подавим протонирование глицина, то эффективный заряд его будет очень маленьким. И подвижность его будет соответствовать не самой маленькой частице, да еще и гидратированной, с зарядом 0.002е.
Концентрирующий гель д.б. такого объема, чтобы за время пребывания в нем система стала равновесной. Соответственно, чем больше мы наносим пробы и ем больше в ней ионогенных примесей, тем большую часть объема он должен занимать.
Этап. Разделяющий гель
Надо создать щелочную среду, чтобы резко увеличить подвижность глицина. Эффективный заряд увеличится на 2 прядка, засчет того, что заряд – логарифмическая величина.
Глицин обгонит все область БП.
Если посмотреть на свет, видны тонкие зоны – если много мажорного продукта
Разделение идет примерно по массе с поправкой на денатурацию.
Изоэлектрофокусирование (IEF)
Для разделения используется изоэлектричекая точка. (ИТ)
Если создадим градиент рН, и на фоне его создадим электрическое поле нужного напрвления, то создадим систему, в которой белки создадут стабильные зона в тех местах, где рН=ИТ. Зоны будут иметь резкие границы и будут стабиьными пока приложено ЭП.
В системе существуют силы, которые следят за тем, чтобы система оставалась равновесной, при попытке, например, с помощью диффузии, это состояние нарушить.
|
Одна проблема – создать градиент рН, да еще с достаточной буферной емкостью.
Белки – амфолины, и учавствуют в создании градиента тоже!
Чаще всего полипептиды и использубт для созданяградиента.
Сомое веселое, создать градиент рН можно с помощью того же изоэлектрического фокусирования.
В пределе ток будет маленьким и будет обусловлен только амфолинами, вышедшими из своих зон.
Надо только подобрать амфолины так, чтобы они перекрывали весь нужнй нам диапазон рН. Иначе сам белок будет этим самым амфолином и сформирует широкую зону, т.к. концентрация маленькая.
Недостаток – система нестабильна в пространстве и при небольших флуктуациях часть амфолинов может перейти в анодную или в катодную камеру.
Для подаления конвекции используется ПААГ небольшой процентности. Более того, иногда для этих целей используется бумага или вообще любая пористая структура, т.к. так же, как и изотахофорез, это процесс равновесный.
Чтобы зафиксировать в пространстве, используют иммобилизованные амфолины – гели или полоски пористого материала, изготовленные на заводе. В нужных местах уже ковалентно присоединены амфолины в нужном количестве.
Техническая проблема – отведение тепла.
Тонкий гель
Образцы можно наносить в любое место такой системы, т.к. все равно сформируется равновесное состояние, которое не зависит от исходного.
Эти 2 метода сейчас в эксперименте часто используются комбинированно.
Двумерный Э/Ф белков
Основа протеомики.
Сначала проводится изоэлектрофокусирование на тонкой полоске, а уже потом эта полоска используется как зона нанесения для ДИСК, заодно решается проблема концентрирования.
Типичный пример – разделение белков Е.соли.
СпециальныеЭ/Ф для НК
применительно к НК – переход в одноцепочечную форму
o нагревание выше 65-70º C
o хаотропные агенты: (NH2)2CO, HCONH2
o pH > 9.5-10
Есть линейный участок в логарифмических координатах зависимости подвижности от длины.
Если речь идет о структурно других НК, например, кольцевых плазмид, да еще и замкнутых, то там подвижность может значительно меняться в зависимости от структуры.
Самая подвижная – суперскрученная, причем существенно. Засчет этого большая гибкость в любом месте. Стоит сбросить супервитки – еще меньше. А у линейной подвижность относительно релаксированной м.б. как больше, так и меньше. Зависит это от длины, от условий, от состава геля,
|
|
|
Наброски и зарисовки растений, плодов, цветов: Освоить конструктивное построение структуры дерева через зарисовки отдельных деревьев, группы деревьев...
Таксономические единицы (категории) растений: Каждая система классификации состоит из определённых соподчиненных друг другу...
Семя – орган полового размножения и расселения растений: наружи у семян имеется плотный покров – кожура...
Автоматическое растормаживание колес: Тормозные устройства колес предназначены для уменьшения длины пробега и улучшения маневрирования ВС при...
© cyberpedia.su 2017-2024 - Не является автором материалов. Исключительное право сохранено за автором текста.
Если вы не хотите, чтобы данный материал был у нас на сайте, перейдите по ссылке: Нарушение авторских прав. Мы поможем в написании вашей работы!