Бактериологическое исследование

Бактериологическое исследование

Классическое бактериологическое исследование это «золотой» стандарт микробиологической диагностики. Целью бактериологического исследования является выделение чистой культуры возбудителя и ее идентификация.

Алгоритм бактериологического исследования:

- первичная микроскопия исследуемого материала (необязательный этап, в зависимости от характера материала);

- первичный посев с целью выделения чистой культуры;

- накопление чистой культуры;

- изучение комплекса биологических свойств выделенной культуры;

- окончательная идентификация возбудителя.

1 день исследования:

1. Первичная микроскопия

Результат первичной микроскопии дает ориентировочное представление о наличии в клиническом материале различных морфологических форм микроорганизмов, а также позволяет провести их первичную идентификацию по морфолого-тинкториальным свойствам и осуществить выбор сред для первичного посева.

2. Первичный посев

Исследуемый материал после первичной микроскопии или без нее (фекалии, моча, мазок из носа и зева, кровь) засевают на соответствующие среды, для выделения чистой культуры:

- сахарный бульон, кровяной агар - для стрептококков;

- ЖСА, кровяной агар-для стафилококков;

- среда Эндо - для бактерий сем. Enterobacteriaceae;

- МПА - для Гр(-) бактерий;

- МПА (посев по методу Шукевича) - для выделения протея;

- среда Китта -Тароцци - для выделения анаэробов;

- среда Сабуро - для выделения грибов.

Посев является первым этапом бактериологического исследования (если не проводится первичная микроскопия).

Посев осуществляется следующим образом:

Посев штрихом с обжигом петли.

Материал забирают прокаленной бактериологической петлей и штрихом густо засевают верхнее поле чашки. Далее петлю опять прокаливают и вносят в густо засеянный сектор и проводят 2-3 вертикальные линии по всей чашке. После этого чашку переворачивают, густо засеянный сектор остается на нижнем поле чашки. Петлю опять прокаливают и посев разносят по чашке 2-3 горизонтальными штрихами.

Посев шпателем.

Материал наносят на поверхность среды шпателем или пипеткой, а затем шпателем рассеивают по всей поверхности.

Посев тампоном.

Для посева тампон с исследуемым материалом вносят в чашку и круговыми движениями втирают его содержимое в питательную среду.

Посев по секторам.

При таком посеве дно чашки расчерчивают на секторы, посев проводят штриховыми движениями от края чашки к центру и по секторам.

День исследования

1. Проводят учет роста на питательных средах:

- рост однородный; рост неоднородный;

2. Проводят описание культуральных свойств.

Алгоритм описания колоний.

В результате роста на питательной среде образуются колонии (потомки одной клетки ). Отбирают изолированные колонии и изучают их- это второй этап исследования, направленный на изучение культуральных свойств бактерий. Эти свойства необходимы для идентификации полученной чистой культуры, так как каждому виду микроорганизмов при росте на определенной питательной среде соответствуют определенные культуральные свойства.

Колонии изучают:

- макроскопически: невооруженным глазом в проходящем и отраженном свете;

- микроскопически -при малом увеличении сухой системы микроскопа..

В проходящем свете изучают:

- величину колоний (крупные, средние, мелкие, карликовые); форму колоний (правильная, неправильная, круглая); прозрачность колоний (прозрачная, непрозрачная).

В отраженном свете:

- определяют цвет (бесцветные или окрашенные); характер поверхности (гладкая, бугристая, блестящая, шероховатая); высоту колоний над поверхностью среды (вдавленная, плоская, возвышающаяся).

Микроскопически:

- край (ровный, неровный); структура (гомогенная, негомогенная).

Изучение колоний заканчивается приготовлением мазка, окраской его по методу Грама и микроскопией. При взятии материала из колонии для приготовления мазка оценивается ее консистенция (мягкая, слизистая, сухая).

Если при микроскопии культура оказалась чистая, то ее пересевают на скошенный агар для накопления.

3 день исследования:

1. Описание характера роста на скошенном агаре:

- однородный, неоднородный; по штриху, сплошной, сливной.

2. Проверка чистоты накопленной культуры.

Готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Если накоплена чистая культура, то она подвергается дальнейшей идентификации. Идентификация бактерий до рода и вида основана на изучении особенностей метаболизма - биохимическая идентификация и антигенного строения -серологическая идентификация.

3. Изучение биохимических свойств.

Биохимические свойства -это способность бактерий расщеплять те или иные субстраты за счет продукции соответствующих ферментов. Для изучения биохимических свойств используют дифференциально-диагностические среды, содержащие различные субстраты (пестрый ряд). В их состав входят среды Гисса с углеводами, лакмусовое молоко, желатин, среды с аминокислотами, МПБ с индикаторами на сероводород и индол.

Сахаролитические свойства изучают на средах Гисса. В их состав входит пептонная вода, субстрат - углевод (различные моно- и полисахариды), многоатомные спирты и индикатор.

Если у бактерий есть ферменты расщепляющие субстрат-углевод, то они выделяют продукты метаболизма (кислоту или кислоту и газ) и индикатор меняет цвет среды. При образовании газа, регистрируются разрывы среды.

Протеолитические свойства - изучаются при посеве на желатин и лакмусовое молоко. Если у бактерий есть протеазы, то желатин разжижается. В молоке появляется сгусток кремового цвета, а над ним жидкость - пептонизация молока (за счет того, что протеазы бактерий расщепляют казеин молока до пептона).

Пептолитические свойства. Чаще бактерии способны расщеплять промежуточные продукты распада белков пептоны. Продукты этого процесса - амины (скатол, индол), аминокислоты, газы (сероводород, аммиак, углекислый газ).

Их можно обнаружить с помощью индикаторной бумаги:

- лакмусовая - для выявления аммиака;

- смоченная щавелевоуксусной кислотой - для выявления индола ;-

- смоченная ацетатом свинца - для выявления сероводорода.

Продукты дезаминирования и декарбоксилирования аминокислот, обнаруживают с помощью тест - полос, изменяющих свой цвет при изменении РН среды.

4 день исследования:

1. Учет результатов биохимических тестов.

После того как культура идентифицирована до вида у нее изучают ряд дополнительных признаков, таких как чувствительность к антибиотикам, токсигенность, наличие факторов вирулентности, плазмидный профиль, а также проводят внутривидовую дифференцировку.

2. Результаты биохимической идентификации являются основанием для проведения серологической идентификации. Серологическая идентификация выделенной культуры проводится в реакции агглютинации на стекле с помощью соответствующих иммунных адсорбированных сывороток, выбор которых определяется результатами биохимической идентификации.

Внутривидовая дифференциация это определение принадлежности штамма к тому или иному фаговару, бактериоциногеновару, бактериоциновару, биовару, резистовару и т.д. Она позволяет выявить эпидемиологичяеские связи между штаммами одного вида.

Идентификация выделенной культуры позволяет сделать заключение о том, какой микроорганизм является этиологическим фактором заболевания. При выделении условно-патогенных бактерий необходимо соблюдать критерии этиологической значимости:

- присутствие бактерий в материале из патологического очага в количестве не менее 10⁵КОЕ мл /г;

- повторное выделение из материала той же культуры;

- нарастания титра антител в сыворотке крови больного к аутоштамму в 4 и более раза.

Индикация вируса

Вирусы размножаются лишь в живых клетках. В связи с этим культивирование вируса осуществляется в организме животного, куриного эмбриона или в культуре ткани

Культивирование вируса в организме животных. Чаще всего этот метод используют для выделения вирусов, не способных вызывать цитопатическое действие в культуре клеток и не способных размножаться в куриных эмбрионах (некоторые арбовирусы, вирус бешенства, вирусы ящура, вирусы Коксаки, вирусы лимфоцитарного хориоменингита). Исследуемый материал вносят в организм с учетом тропизма вируса к определенным тканям.

Культивирование в куриных эмбрионах. В тканях эмбриона, его оболочках, желточном мешке размножаются многие патогенные вирусы. При культивировании учитывается тропность вируса к определенной ткани. Для исследования берут аллантоисную жидкость; ее отсасывают пипеткой после прокола хорион-аллантоисной оболочки. Наличие вируса в аллантоисной и амниотической жидкости зараженного эмбриона определяют в иммунологических реакциях.

Культивирование в культуре ткани. В настоящее время наибольшее практическое применение получили однослойные культуры первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеток. Источником получения клеток служат ткани эмбрионов, а также ткани, извлеченные у человека при операции. Чаще всего применяют культуры клеток, полученных из нормальных и раковых тканей организма. Широко используют линии клеток Hela, полученные из опухолей шейки матки; Hep-2, полученные из злокачественной опухоли гортани; КВ – из ткани рака полости рта. После культивирования в культуре ткани, индикацию наличия вируса проводят по выявлению специфической дегенерации клеток. Для этого зараженные культуры клеток просматривают под малым увеличением микроскопа и регистрируют цитопатическое действие вируса на клетку, которое может проявиться в образовании многоядерных гигантских клеток и симпластов; дегенерации клеток и развитии очагов клеточной пролиферации, а также в образовании внутриклеточных включений в цитоплазме или ядре пораженных клеток или по цветной пробе (наличию или отсутствию роста в чувствительных тест-системах).

Первичные культуры клеток – это однослойные культуры, которые способны размножаться только в первичной генерации. Для получения первичных культур используют исходный материал: эмбриональные или зрелые ткани животных.

Культуры полуперививаемых клеток – получают из различных тканей эмбриона человека, из первичных культур. Клетки полуперевиваемых культур быстро размножаются, выживают до месяца, при ежедневной смене среды. Высокочувствительны ко многим вирусам.

Культуры перевиваемых клеток – это культуры клеток, способные бесконечно долго размножаться вне организма при культивировании. При длительных пассажах их исходные свойства могут изменяться. Для сохранения исходных свойств маточную культуру клеток выращивают в матрацах с питательной средой, ежедневно пассируя.

 

Индикация вируса по цитопатическому (ЦПД) действию. ЦПД – это совокупность морфологических и функциональных изменений, происходящих в клетке под влиянием внутриклеточного вируса, приводящих к нарушению метаболизм клеток, прекращению синтеза НК, подавлению синтеза белка. Происходит освобождение и активация клеточных лизосомальных ферментов, которые вызывают деструкцию клеточных компонентов, то есть развитие ЦПД, что выражается в симпластообразовании, образовании включений, пикнозе ядра.

Индикация вируса по ЦПД. Проводят заражение исследуемым материалом однослойных культур (монослой клеток). Для этого просматривают под малым увеличением микроскопа сплошной клеточный слой. Культуральную жидкость осторожно отсасывают пипеткой и вносят по 0,1 мл исследуемого материала в пробирку и добавляют питательную среду до 1 мл. Для контроля несколько пробирок оставляют незараженными. Пробирки выдерживают в термостате при 37⁰С и ежедневно микроскопируют с целью обнаружения ЦПД.

Индикация вируса в реакции гемадсорбции. Гемадсорбция – это способность культуры клеток, которая заражена вирусом, адсорбировать на своей поверхности эритроциты. Этот феномен связан со способностью встраиваться в мембрану зараженных вирусом клеток вирусспецифических белков-гемагглютининов, к которым присоединяются эритроциты за счет специальных рецепторов и адсорбируются на поверхности зараженных клеток.

Индикация вируса по цветной пробе. Цветная проба основана на регистрации изменения цвета среды, которая содержит фенолрот (индикатор) и помещенный в нее исследуемый материал. Если в материале есть вирус, он разрушает клетки монослоя и они становятся неспособнымы к метаболизму. Собственных систем метаболизма вирус не имеет, следовательно, кислых продуктов метаболизма не выделяет, и цвет питательной среды не меняется. Если в материале нет вируса, то клетки монослоя живут, функционируют, выделяют кислые продукты метаболизма, что приводит к изменению цвета среды, она приобретает желтый цвет.

Идентификация вируса

Идентификацию вируса до уровня семейства проводят с помощью следующих тестов:

1. Определение типа нуклеиновой кислоты вириона. Интерпретацию результатов проводится по цветной пробе, то есть по наличию или отсутствию роста в чувствительных тест-системах. Размножение ДНК-содержащих вирусов ингибируется бромдезоксиуридином, в то время как РНК-содержащие вирусы нечувствительны к этому реактиву.

2. Определение наличия суперкапсидной оболочки..Вирусы, имеющие суперкапсидную оболочку, содержат липиды и поэтому чувствительны к обработке эфиром. При последующем испытании биологической активности они теряют свою инфекционность.

3.О пределение размеров вириона. Размер вириона определяют по способности вируса проходить через поры мембранных фильтров известного диаметра. До и после фильтрации проверяют инфекционность исследуемого материала методом цветной пробы.

4.О пределение наличия или отсутствия гемагглютинина. Некоторые вирусы обладают гемагглютинирующей активностью. Ее учитывают в реакции гемагглютинации.

5.Идентификацию вируса до вида, внутривидовую идентификацию чаще всего проводят в реакции вируснейтрализации с соответствующими сыворотками.

6.Учет результатов реакции проводится в зависимости от биологии вируса:по результатам РТГА; по цветной пробе; по отсутствию цитопатического действия; по выживаемости чувствительных животных;

- по отсутствию изменений при заражении куриных эмбрионов.

 

МИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Микологическое исследование

Культуральное исследование. Культуральное исследование основано на выделение возбудителя из исследуемого материала. Сроки культивирования различны для разных видов грибов (от 2-4 дней до 4 недель), при подозрении на диморфные грибы культуру выделяют до 8 недель. Основными средами для культивирования в микологической лаборатории является среда Сабуро: декстрозный агар Сабуро (плотная среда), бульон Сабуро (жидкая среда). Для подавления роста бактериальной флоры в среду Сабуро добавляют антибиотики (хлорамфеникол, гентамицин, реже стрептомицин, пенициллин). Для подавления роста сапрофитных грибов в среду добавляют циклогексимид, хлорамфеникол. Существуют готовые среды с циклогексимидом (Mycobiotic Mycosel).

Оптимальным режимом культивирования для большинства патогенных грибов является 30⁰С, 20-25⁰С, реже 37⁰С – при подозрении на диморфные грибы. Длительность инкубации для большинства грибов составляет не более 4 недель; если по прошествию этого времени роста не наблюдается, то дают отрицательный ответ. В случае подозрения на диморфный микоз при отсутствии роста в течение 4 недель, культуру выдерживают 8 недель и только после этого дают отрицательный результат.

При культуральном исследовании диагностически значимым являются:

- выделение любого плесневого гриба, если этот гриб был обнаружен микроскопически;

- выделение плесневого или дрожжевого гриба, при исследовании стерильного в норме материала;

- выделение диморфного гриба;

- выделение грибов рода Cryptococcus;

- выделение дерматофитов из кожи, волос, ногтей.

Фекалии.

1.Макроскопическое исследование. Исследование начинают сосмотра всей порции кала для обнаружения невооруженным глазом или с помощью лупы целых гельминтов или их фрагментов. Фекалии разводят водой до жидкой консистенции и небольшими порциями рассматривают в стеклянном кристаллизаторе или чашке Петри при хорошем освещении на темном фоне.

Чтобы лучше просмотреть кал, применяют метод отстаивания. В высоких стеклянных банках смешивают кал с большим количеством воды и отстаивают. Жидкость сливают, а осадок снова разводят водой. Так проделывают несколько раз, пока жидкость не станет прозрачной. Осадок исследуют с помощью лупы.

Все образования, подозрительные на фрагменты гельминтов, рассматривают между двумя предметными стеклами, под лупой в капле глицерина, а при необходимости под микроскопом.

Дифференциация отдельных видов гельминтов основана на их анатомо-морфологических особенностях.

Определение вида нематод возможно по целям особям, реже - по крупным фрагментам, сохранившим характерные органы. Цестоды идентифицируют по зрелым членикам, гермафродитным членикам и сколексам.

Макроскопическое исследование позволяет обнаружить острицы, членики или обрывки стробилы.

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Микроскопическое исследование. Целью микроскопического исследования является обнаружение в исследуемом материале микроорганизмов. Обнаружение в приготовленном мазке микроорганизмов при некоторых бактериальных (гонорея, туберкулез, возвратный тиф, сифилис), грибковых инфекциях и протозойных (малярия, трихоманиоз, лямблиоз) инвазиях имеет определенное диагностическое значение.

Если при исследовании стерильных в норме жидкостей, при первичной микроскопии выявляют микроорганизмы, это дает возможность постановки предварительного диагноза, назначения и проведения адекватной терапии.

В бактериологических лабораториях применяют не только обычные методы оптической микроскопии в проходящем свете, но и специальные: в темном поле зрения, фазово-контрастной и люминесцентной микроскопии.

Иммерсионная микроскопия. Иммерсионная микроскопия проводится с использованием иммерсионного объектива с высокой разрешающей способностью разрешающая способность это – минимальное расстояние между двумя точками, при котором они еще видны раздельно). Его фронтальную линзу погружают в иммерсионное масло, показатель преломления которого близок к показателю преломления стекла, что увеличивает разрешающую способность микроскопа.

В этом случае лучи света, которые проходят через препарат, не меняют своего направления и не рассеиваются, а попадают в объектив, что позволяет рассмотреть объекты увеличенными в 1000 раз.

Темнопольная микроскопия. Микроскопия в темном поле зрения проводится с использованием специального приспособления - конденсора темного поля. При микроскопии этим методом исследуемый препарат освещается сбоку косыми лучами, которые не попадают в объектив. В объектив попадают только отраженные от объекта лучи. При проведении темнопольной микроскопии применяют специальный конденсор - параболоид, в котором центральная часть линзы непрозрачная, а боковая поверхность конденсора зеркальная, он задерживает центральные лучи и образует темное поле зрения. Отраженные лучи попадают на боковую поверхность конденсора, отражаются от нее и концентрируются в фокусе. В связи с этим микробные клетки видны ярко светящимися на черном фоне.

В практических лабораториях лечебно-профилактических учреждений темнопольная микроскопия используется для обнаружения в нативных препаратах возбудителей сифилиса, возвратного тифа, лептоспироза и для изучения подвижности бактерий.

Фазово-контрастная микроскопия. При проведении фазовоконтрастной микроскопии пользуются фазовоконтрастным устройством, которое позволяет превратить изменение фазы лучей, проникающих через частицы неокрашенного препарата, в изменения амплитуды, которые можно воспринимать человеческим глазом.

Используемое для фазовоконтрастной микроскопии приспособление включает конденсор с набором кольцевых диафрагм, фазовоконтрастных объективов и окуляров. При микроскопии свет, который проходит через участки препарата, проникает через фазовое кольцо и дает светлое изображение фона. А микробные клетки становятся темными на светлом фоне. Этот метод используется для обнаружения и характеристики подвижности холерного вибриона и лептоспир

Люминесцентная микроскопия. Этот вид микроскопии основан на регистрации люминесценции, то есть способности некоторых веществ светиться под действием коротковолновых (например, ультрафиолетовых) лучей света. При люминесцентной микроскопии препараты окрашивают специальными светящимися люминесцентными красителями-флюорохромами (акридиновый оранжевый, изоацетат флюоресцента). Этим методом выявляют флюоресценцию анаэробных бактерий (Fusobacterium Prevotella), что обусловлено присутствием флюорохромных веществ в их клетке. Флюорохромы, связавшись с белками, образуют стойкие комплексы, которые можно обнаружить в люминесцентном микроскопе - они оранжево-красного или коричнево-красного цвета.

 

Электронная микроскопия. В микробиологии электронная микроскопия используется для изучения ультраструктуры бактерий, грибов, простейших, а также для изучения вирусов.

Различают несколько видов электронной микроскопии:

а) трансмиссивная - при которой изображение получают благодаря прохождению электронов через образец.

б) сканирующая (растровая) - при которой пучок электронов быстро сканирует поверхность объекта и вызывает излучение, которое с помощью катодно-лучевой трубки формирует изображение на светящемся экране микроскопа. Источником света является источник электронов, источником электронов является электронная лампа. Электроны, проходящие через объект за счет его разной толщины и электронноплотности отклоняются под разными углами и попадают в объектив, где формируется первое полезное увеличение объекта. Линза объектива дает промежуточное увеличение изображения. Проекционная линза позволяет увеличить изображение во много раз. Это увеличенное изображение попадает на флюоресцирующий экран и может фотографроваться.