История развития хранилищ для нефти: Первые склады нефти появились в XVII веке. Они представляли собой землянные ямы-амбара глубиной 4…5 м...
Состав сооружений: решетки и песколовки: Решетки – это первое устройство в схеме очистных сооружений. Они представляют...
Топ:
Генеалогическое древо Султанов Османской империи: Османские правители, вначале, будучи еще бейлербеями Анатолии, женились на дочерях византийских императоров...
Оценка эффективности инструментов коммуникационной политики: Внешние коммуникации - обмен информацией между организацией и её внешней средой...
Техника безопасности при работе на пароконвектомате: К обслуживанию пароконвектомата допускаются лица, прошедшие технический минимум по эксплуатации оборудования...
Интересное:
Принципы управления денежными потоками: одним из методов контроля за состоянием денежной наличности является...
Уполаживание и террасирование склонов: Если глубина оврага более 5 м необходимо устройство берм. Варианты использования оврагов для градостроительных целей...
Что нужно делать при лейкемии: Прежде всего, необходимо выяснить, не страдаете ли вы каким-либо душевным недугом...
Дисциплины:
2017-09-30 | 939 |
5.00
из
|
Заказать работу |
|
|
Целью данной работы является знакомство на практике с одним из традиционных методов количественного определения фосфора в объектах биологического происхождение и выявление снижения концентрации неорганического фосфора в культуральной жидкости за счет его потребления в процессе гликолиза дрожжевыми клетками.
В данной работе используется классический метод определения неорганического фосфора по Фиске – Суббароу.
Метод позволяет определить от 0,2 до 2 мкмолей неорганического фосфата в пробе. Определение неорганического фосфата проводят прямо из исследуемого раствора. Если в исследуемом растворе содержится белок, то необходимо его предварительно удалить.
Для исследования используют два раствора. Первый образец представляет собой свежеприготовленную питательную среду с определенной концентрацией неорганического фосфата, необходимого для культивирования дрожжей рода S. сerevisiae. Второй образец представляет собой культуральную жидкость, оставшуюся после трехчасового культивирования в ней дрожжевых клеток. Как известно, в процессе гликолиза, лежащего в основе спиртового брожения у дрожжей, происходит потребление неорганического фосфата и включение его в состав органических молекул (образование 1,3 дифосфоглицериновой кислоты).
Таким образом, для определения количеств использованного в процессе гликолиза фосфора необходимо определить его концентрацию в культуральной жидкости до и после процесса культивации клеток. Для этого при исследовании второго образца в нем предварительно производят осаждение клеток путем центрифугирования при 3000 об./мин. в течение 4 минут, после чего надосадочную жидкость дополнительно фильтруют через бумажный фильтр и в полученном фильтрате определяют концентрацию неорганического фосфата.
|
Реактивы:
1. (МН4)2МоО4 - 2,5 % -ный раствор.
2. H2SO4 - 5 н. раствор.
3. Молибденовый реактив - смесь равных объемов молибденовокислого аммония (1) и серной кислоты (2).
4. Эйкологен (1,2,4 - аминонафтолсульфоновая кислота);основной раствор: 250 мг эйконогена, 15 г NaHSO3 (илиNa2S2O5, 14 г) и 0,5 г Na2SO3 растворяют в 100 мл воды. Раствор можно хранить в темной склянке длительное время.
Рабочий раствор эйконогена: 1 объем основного раствора и 4 объема дистиллированной воды, хорошо перемешивают, если необходимо, фильтруют. Раствор может храниться в темноте несколько дней.
5. Стандартный раствор фосфата (КН2РО4), содержащий 2 мкмоля фосфата в 1 мл. В качестве антисептика к раствору добавляют 1 - 2 капли хлороформа.
б. Магнезиальная смесь - 20 г МgСl2*бН2О и 40 г NH4C1 растворяют в 200 мл воды и добавляют 20 мл концентрbрованного аммиака.
7. Фенолфталеин - 0,5%-ный спиртовой раствор.
8. КОН - 10%-ный раствор.
9. СС13СООН - 5%-ный раствор.
10. НС1О4 - 5%-ный раствор
Ход работы
ОПЫТ №1. Определение содержания неорганического фосфора в культуральной жидкости до проведения процесса культивирования дрожжей
Определение производят минимум в двух параллелях. Для исследования берут 1 мл свежеприготовленной культуральной жидкости (образец № 1), содержащему от 0,2 до 2 мкмолей неорганического фосфата, к нему добавляют 1,5 мл дистиллированной воды и 1,5 мл молибденовой смеси. Содержимое пробирок хорошо перемешивают.
Затем во все пробы добавляют по 1 мл рабочего раствора эйконогена, все снова перемешивают и помещают в водяную баню при 37°С на 10 - 15 мин (или оставляют при комнатной температуре на 30 - 40 мин.). После этого раствор охлаждают и фотометрируют при 625 нм.
Содержание фосфата в пробе рассчитывают по калибровочному графику. Для построения графика проводят определение фосфора в стандартном растворе КН2РО4, беря различные его количества в пределах чувствительности данного метода, а именно от 0,2 до 2 мкмолей фосфата в пробе для колориметрирования (5 мл). По результатам фотометрирования стандартного раствора фосфата строят график зависимости интенсивности окраски от количества взятого вещества. По оси ординат откладывают значения (оптической плотности) по оказанию ФЭКа, а по оси абсцисс - количество фосфата в данной пробе. Калибровочный график должен иметь вид прямой, выходящей из начала координат.
|
Необходимо помнить, что интенсивность окраски определяется концентрацией фосфора, по зависит также от температуры и времени развития окраски. Поэтому при колориметрировании необходимо придерживаться определенных стандартных условий.
ОПЫТ №2. Определение содержания неорганического фосфора в культуральной жидкости после проведения процесса культивирования дрожжей
Для определения концентрации неорганического фосфата в образце № 2 сначала производят удаление из него дрожжевых клеток. Эта процедура осуществляется с помощью центрифугирования с последующей фильтацией (см. выше).
После этой прпоцедуры из исследуемого раствора необходимо удалить белки, которые могут оказаться в культуральной жидкости. По этой причине определение фосфора в образце № 2 необходимо производить в два этапа.
2.1. Удаление белков из исследуемой жидкости
Белки из исследуемого раствора осаждают трихлоруксусной или хлорной кислотой, добавляя ее к раствору до конечной концентрации 2,5%. Раствор хорошо перемешивают, осадок белка удаляют фильтрованием или центрифугированием.
От трихлоруксусной кислоты можно освободиться путем повторного встряхивания раствора с 5 - 10-кратным объемом насыщенного водой эфира. Трихлоруксусная кислота переходит при этом в эфирную фракцию. После встряхивания и отстаивания эфир отсасывают водоструйным насосом.
Хлорную кислоту удаляют в виде калиевой соли (KClO4), образующейся при нейтрализации раствора концентрированным КОН. После добавления КОН раствор хорошо охлаждают и осадок удаляют центрифугированием на холоде. Растворимость KClO4 при 0°С очень мала.
Вместо процедуры по удалению кислот безбелковый раствор можно просто нейтрализовать щелочью. При этом необходимо определить конечный объем пробы.
2.2. Определение концентрации неорганического фосфата
|
Эта процедура происходит в соответствии с вышеизложенным (см. п.1).
ОПЫТ №3. Определение количества неорганического фосфата, потребленного дрожжевыми клетками в процессе культивирования
По калибровочному графику определяется количество фосфора в обоих образцах и по разнице между этими величинами рассчитывается количество фосфора, потребленного в процессе гликолиза.
Лабораторная работа №8
МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ УГЛЕВОДОВ В РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ.
|
|
Типы сооружений для обработки осадков: Септиками называются сооружения, в которых одновременно происходят осветление сточной жидкости...
Историки об Елизавете Петровне: Елизавета попала между двумя встречными культурными течениями, воспитывалась среди новых европейских веяний и преданий...
Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим...
Семя – орган полового размножения и расселения растений: наружи у семян имеется плотный покров – кожура...
© cyberpedia.su 2017-2024 - Не является автором материалов. Исключительное право сохранено за автором текста.
Если вы не хотите, чтобы данный материал был у нас на сайте, перейдите по ссылке: Нарушение авторских прав. Мы поможем в написании вашей работы!