А. И. Грицук, В. Т. свергун, А. Н. Коваль

Министерство здравоохранения Республики Беларусь

Учреждение образования «Гомельский государственный медицинский университет»

Кафедра биохимии

А. И. Грицук, В. Т. свергун, А. Н. Коваль

БИОХИМИЯ

Практикум

Разделы: «Биохимия белков, витаминов и гормонов»

занятие 19 Белки-1. Переваривание и всасывание белков.

Занятие 20 Белки-2. Тканевый обмен аминокислот. Обезвреживание продуктов обмена.

занятие 21 Белки-3. Особенности обмена отдельных аминокислот в норме и при патологии.
занятие 22 Белки-4. Нуклеопротеиды. Структура и функции информационных макромолекул.

занятие 23 Белки-5. Биосинтез белка. Регуляция биосинтеза. Патология белкового обмена

ЗАНЯТИЕ 24 Витамины.

занятие 25 Гормоны-1. Общая эндокринология. Механизм действия гормонов.
занятие 26 Гормоны-2. Частная эндокринология. Гормоны эндокринных желез.

занятие 27 Контрольное занятие по разделам «биохимия белков и нуклеиновых кислот» и «биохимия витаминов и гормонов»

Гомель 2016

Раздел 5 Биохимия белков и нуклеиновых кислот

Занятие 19

Белки-1. Переваривание и всасывание белков

Цель занятия: сформировать представления о пищевой ценности белков, молекулярных механизмах их переваривания и всасывания в желудочно-кишечном тракте, путях формирования пула свободных аминокислот тканей и жидкостей организма. Освоить методы определения кислотности и патологических компонентов желудочного сока.

 

Исходный уровень знаний и навыков

Студент должен знать:

1 Строение, классификацию и свойства основных классов аминокислот.

2 Уровни структурной организации белковой молекулы.

3 Механизмы мембранного транспорта веществ

4 Механизм микросомального окисления..

Студент должен уметь:

1 Проводить титрационный анализ.

2 Проводить качественные реакции на кровь и молочную кислоту.

 

Структура занятия

Теоретическая часть

1.1 Заменимые и незаменимые аминокислоты. Роль белков в питании. Полноценные и неполноценные белки. Нормы белка в питании. Азотистый баланс.

1.2 Обмен простых белков. Переваривание белков в ЖКТ. Состав и свойства желудочного сока. Значение компонентов сока в переваривании белков (HCl, пепсин, слизь и др.). Характеристика пепсина. Механизмы образования и секреции HCl в желудочном соке. Регуляция секреции HCl (роль гистамина, гастрина, ацетилхолина и др.).

1.3 Кишечный сок. Его состав и свойства. Характеристика панкреатических и кишечных ферментов. Механизм активации трипсина, химотрипсина и др.

1.4 Значение градиента pH соков ЖКТ в переваривании белков. Механизмы переваривания белков и всасывания аминокислот в ЖКТ.

1.5 Медиаторы и гормоны ЖКТ – гистамин, серотонин, секретин, холецистокинин, гастроингибирующий пептид, соматостатин, глюкагон, энкефалины и др.

1.6 Гниение белков в толстом кишечнике. Образование индола, скатола, фенола, сероводорода, аммиака, аминов и др., их роль и механизмы обезвреживания в печени.

1.7 Эндогенный пул аминокислот в тканях – пути формирования и утилизации.

Практическая часть

2.1 Решение задач.

2.2 Проведение повторного инструктажа по технике безопасности.

2.3 Лабораторные работы.

Задачи

1. Роль белка в питании:

а) источник витаминов группы В; б) источник «биогенного» азота; в) источник микроэлементов; г) источник незаменимых аминокислот; д) источник нуклеотидов?

2. К заменимым аминокислотам относятся:

а) аланин; б) пролин; в) изолейцин; г) треонин; д) глицин?

3. Положительный азотистый баланс наблюдается:

а) при голодании; б) в период роста организма; в) при заболеваниях ЖКТ; г) при физической нагрузке; д) при терапии анаболическими стероидами?

4. Какие ферменты расщепляют белок в желудке?

а) пепсиноген; б) гастриксин; в) пепсин; г) химотрипсин; д) гастрин.

5.Трипсин активируется:

а) аутокаталитически; б) ионами Ca²⁺; в) антитрипсином; г) энтеропептидазой; д) путём ограниченного протеолиза?

6. Ключевыми ферментами для синтеза соляной кислоты являются:

а) пепсин; б) карбоксипептидаза; в) карбангидраза; г) каталаза; д) Н⁺/К⁺-АТФ-аза?

7. Выберите пары аминокислот, которые замедляют всасывание друг друга в кишечнике:

а) арг и лиз; б) вал и глу; в) лиз и лей; г) глу и асп; д) гли и гис?

8. Триптофан под действием кишечной микрофлоры может превратиться в:

а) крезол; б) фенол; в) индол; г) скатол; д) ментол?

9.Какие вещества используются в печени для обезвреживания продуктов гниения белков, поступивших из кишечника?

а) ФАФС; б) ГАГ; в) УДФГК; г) глу; д) ИТФ.

10.Какие процессы могут служить источником эндогенного пула аминокислот?

а) биосинтез белка; б) протеолиз белков пищи; в) протеолиз белков катепсинами; г) синтез биогенных аминов; д) синтез заменимых аминокислот de novo.

 

Лабораторные работы

Лабораторная работа № 1. Количественное определение общей кислотности, общей, свободной и связанной соляной кислоты в одной пробе желудочного сока

Принцип метода. Основан на титровании желудочного содержимого раствором 0,1н NaOH в присутствии индикаторов с различными зонами перехода. Кислотность желудочного сока выражают количеством ммоль едкого натра, нейтрализующего 1 л желудочного сока.

Основные фракции кислот желудочного сока:

“общая кислотность” желудочного сока – это сумма всех кислот желудочного содержимого;

“свободная соляная кислота” – свободная минеральная HCl;

“связанная соляная кислота” – кислореагирующие соли (хлориды) белков и других слабых оснований;

“общая соляная кислота” – сумма свободной и связанной HCl.

Количественное определение свободной соляной кислоты. Свободная соляная кислота оттитровывается раствором 0,1н NaOH в присутствии индикатора диметиламиноазобензола, имеющего зону перехода окраски от красной до оранжевой при pH 3,0. Слабые же кислоты (молочная, уксусная кислота, кислые фосфаты и связанная соляная кислота) при pH 2,9–4,0 находятся в растворе в недиссоциированном состоянии и в реакцию со щелочью не вступают.

Ход работы. К 10 мл желудочного сока добавить 1–2 капли спиртового раствора диметиламиноазобензола и титровать раствором 0,1н NaOH до появления оранжевой окраски.

Произвести расчет на 1000 мл желудочного сока. Так как затраченное на титрование количество едкого натра эквивалентно количеству соляной кислоты в пробе желудочного сока, то количество соляной кислоты в 1 л желудочного сока (в моль/л) составит

a ´ 0,1 ´ 1000

X = ¾¾¾¾¾¾¾ (1)

b

где а	–	количество 0,1н раствора NaOH, затраченное на титрование, мл;
0,1	–	количество NaOH в 1 мл 0,1 N раствора, моль;
b	–	количество желудочного сока, взятого для титрования, мл;
	–	объем желудочного сока, мл.

Количественное определение общей кислотности желудочного сока. Титрование общей кислотности желудочного сока проводится раствором 0,1н NaOH в присутствии индикатора фенолфталеина с зоной перехода окраски в пределах pH 8,2–10,0. При pH ниже 8,2 он бесцветный, а при pH выше 10,0 – красный.

Ход работы. К 10 мл профильтрованного желудочного сока добавить 1–2 капли раствора фенолфталеина и титровать 0,1н раствора NaOH до появления слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин. Произвести расчет на 1000 мл желудочного сока.

Количественное определение общей кислотности, общей, свободной и связанной соляной кислоты в одной порции желудочного сока.

Ход работы. Отмерить в колбочки по 10 мл желудочного сока и добавить по 1-2 капли диметиламиноазобензола и фенолфталеина. Титровать 0,1н раствором NaOH до появления оранжевого окрашивания (первая отметка количества израсходованного 0,1н раствора NaOH). Затем продолжить титрования до лимонно-желтого цвета (вторая отметка) и, наконец, до розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин (третья отметка).

В процессе титрования отсчет ведется от начальной точки!

Первая отметка соответствует количеству свободной соляной кислоты, третья – общей кислотности. Вторая отметка используется для расчета количества общей соляной кислоты. Среднее арифметическое между вторым и третьим пунктом соответствует общей соляной кислоте. Количество связанной соляной кислоты вычисляется как разница между общей и свободной соляной кислотой. Например, при титровании 0,1н раствором едкого натра затрачено титрованного раствора (с начала титрования): до первой отме(оранжевый цвет) – 3,3 мл, до второй (лимонно-желтый цвет) – 4,6, до третьей (розовый цвет) – 5,6 мл. Среднее между второй и третьей отметкой –

(4,6 + 5,6): 2 = 5,1 мл.

Произвести расчет содержания свободной соляной кислоты, общей соляной кислоты, общей кислотности на 1000 мл желудочного сока по формуле (1).

Этот способ расчета неприменим при наличии молочной кислоты в желудке. Поэтому в пробах желудочного сока, содержащего молочную кислоту, ограничиться вычислением свободной соляной кислоты и общей кислотности.

Полученные данные вносятся в таблицу:

Задача	Цвет	V 0,1 н NaOH, мл	Содержание HCl, ммоль/л	Общая кислотность	Выводы
свободная	связанная	общая
	Оранжевый
Желтый
Розовый
	Оранжевый
Желтый
Розовый
	Оранжевый
Желтый
Розовый

Норма. Показатели кислотности профильтрованного желудочного содержимого взрослого человека после стандартногопробного завтрака составляют:

- общая кислотность – 40–60 ммоль/л (новорожденные – 2,8 ммоль/л; дети до года – 4–20 ммоль/л);

- свободная HCl – 20–40 ммоль/л (новорожденные – 0,5 ммоль/л);

- связанная HCl – 10–20 ммоль/л;

- общая HCl – 30–60 ммоль/л.

Клинико-диагностическое значение. При различных заболеваниях желудка кислотность может быть повышенной, пониженной и нулевой. При язвенной болезни желудка или гиперацидном гастрите наблюдается гиперхлоргидрия – увеличение содержания свободной соляной кислоты и общей кислотности. При гипоацидном гастрите или раке желудка отмечается гипохлоргидрия – уменьшение количества свободной соляной кислоты и общей кислотности. При раке желудка, хроническом атрофическом гастрите отмечается полное отсутствие соляной кислоты и значительное снижение общей кислотности – ахлоргидрия. При злокачественном малокровии, раке желудка наблюдается полное отсутствие соляной кислоты и пепсина – ахилия.

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагности­ческую оценку.

 

Лабораторная работа № 2. Обнаружение патологических компонентов желудочного сока

а) Обнаружение молочной кислоты по реакции Уффельмана.

Принцип метода. При взаимодействии фенолята железа, имеющего фиолетовый цвет, с лактатом образуется лактат железа желто-зеленого цвета.

Ход работы. К 20 каплям раствора фенола добавить 1-2 капли раствора хлорного железа. Получается раствор фенолята железа фиолетового цвета. В пробирку с фенолятом железа прилить по каплям желудочный сок (нормальный и сок, содержащий молочную кислоту).

В присутствии молочной кислоты фиолетовая окраска переходит в желто-зеленую вследствие образования лактата железа. При одновременном присутствии соляной кислоты жидкость обесцвечивается. Это объясняется тем, что сильная соляная кислота полностью разрушает комплекс железа с фенолом, а также вытесняет более слабую молочную кислоту из ее соли; вследствие этого реакция на присутствие молочной кислоты отрицательная.

Клинико-диагностическое значение. Органические кислоты (молочная, уксусная, масляная и др.) имеют обычно микробное происхождение и появляются в желудочном содержимом в результате ахлоргидрии и последующего сбраживания компонентов пищи. Наличие органических кислот в желудочном содержимом натощак часто встречается при атрофических гастритах и раке желудка.

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагности­ческую оценку.

 

б) Бензидиновая проба на кровь.

Принцип метода. Гемоглобин обладает каталазной активностью и разлагает пероксид водорода с образованием молекулярного кислорода, который окисляет бензидин или другой краситель. При этом происходит изменение окраски с бесцветной на темно-синюю.

Ход работы. В пробирку с 1 мл желудочного сока добавляют 4-5 капель 0,2 %-го спиртового раствора бензидина и 5 капель 1 %-го раствора пероксида водорода. При наличии в желудочном соке крови в результате окисления бензидина развивается синее окрашивание.

Полученные данные вносятся в таблицу:

Определяемый компонент	Используемые реактивы	Пробы желудочного сока
в норме	при патологии
Общая кислотность	Фенолфталеин
Свободная HCl	Диметиламиноазобензол
Лактат (молочная к-та)	Фенолят железа
Кровь	Бензидин

Примечание – Если результаты какой-либо работы являются отрицательными, то в соответствующей графе ставится прочерк.

Клинико-диагностическое значение. Кровь появляется в желудочном содержимом при изъязвлении стенок желудка при язвенной болезни, эрозивном, язвенном гастрите, ожогах слизистой желудка и раке желудка.

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагности­ческую оценку.

 

 

Рекомендуемая литература

Основная

1 Кухта, В.К и др. Биологическая химия: учебник / В.К. Кухта, Т.С. Морозкина, Э.И. Олецкий, А.Д. Таганович; под ред. А.Д. Тагановича. – Минск: Асар, М.: Издательство БИНОМ, 2008. – С. 261-277.

2 Биохимия: Учебник для вузов / Под ред. Е.С. Северина. – 4-е изд., испр. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. – С. 458-469.

3 Филиппович, Ю. Б. Основы биохимии. – 4-е изд. – М.: Агар, 1999. – С. 261-265.

4 Николаев, А.Я. Биологическая химия. М.: Медицинское информационное агентство, 2004. – С. 330-335.

5 Марри Р. и др. Биохимия человека: в 2-х т.: Пер. с англ., М.: Мир, 2004. – Т.1: С. 299-305, Т.2. С. 274-298.

6 Березов, Т. Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. – М.: Медицина, 1998. – С. 409-429.

Дополнительная

7 Элементы патологической физиологии и биохимии / Под ред. Ашмарина И. П. М.: Изд-во МГУ, 1992. С. 57–69.

 

 

Занятие 20

Белки-2. Тканевый обмен аминокислот.
Обезвреживание продуктов обмена

Цель занятия: сформировать представления об основных путях метаболизма свободных аминокислот в тканях. Изучить механизмы и значение реакций детоксикации аммиака в норме и при патологии. Освоить методы определения концентрации мочевины в биологических жидкостях.

 

Структура занятия

Теоретическая часть

1.1 Основные реакции обмена аминокислот:

1.1.1 Реакции на радикал:

а) гидроксилирование (про, лиз, фен). Механизм микросомального окисления (роль аскорбата, NADPH, цитохрома P450 и др.), примеры, биологическое значение;

б) разрыв (механизм, биологическое значение);

в) метилирование и др.

1.1.2 Реакции на карбоксильную группу:

а) декарбоксилирование (на примере гис, тир, трп, глу) – механизм, ферменты, биологическая роль;

б) восстановление – ферменты, биологическая роль.

1.1.3 Реакции на аминогруппу:

а) виды дезаминирования (окислительное, восстановительное, гидролитическое, внутримолекулярное), их биологическое значение;

б) прямое окислительное дезаминирование – механизм, ферменты, коферменты, биологическое значение;

в) реакции переаминирования – ферменты, коферменты, биологическое значение;

г) непрямое окислительное дезаминирование – механизм, ферменты, коферменты, биологическое значение.

1.2 Аммиак, пути его образования и механизмы токсичности.

1.2.1 Пути детоксикации аммиака:

а) восстановительное аминирование;

б) образование амидов (глн и асн);

в) аммониогенез;

в) биосинтез мочевины, реакции, ферменты, локализация, биологическая роль цикла синтеза мочевины (ЦСМ). Энергетическая емкость ЦСМ. Связь ЦСМ с ЦТК и обменом аминокислот. Роль ЦСМ в регуляции кислотно-основного состояния (КОС).

1.3 Энзимопатии ЦСМ, виды и основные клинические проявления.

1.4 Пути вступления аминокислот в ЦТК (схема). Глико- и кетогенные аминокислоты.

Практическая часть

2.1 Решение задач.

2.2 Лабораторные работы.

Задачи

1. Через какие интермедиаты в ЦТК вступает тирозин?

а) оксалоацетат; б) малат; в) фумарат; г) α-кетоглутарат; д) ацетилкоэнзим А.

2. К гликогенным аминокислотам относятся:

а) гис; б) мет; в) сер; г) лей; д) трп?

3.Для каких аминокислот характерны реакции гидроксилирования?

а) лиз; б) тир; в) гли; г) тре; д) про.

4. Виды декарбоксилирования:

а) альфа; б) бета; в) гамма; г) лямбда; д) омега?

5. Коферментами прямого окислительного дезаминирования являются:

а) FAD; б) NAD⁺; в) NADP⁺; г) коэнзим Q; д) коэнзим А?

6. Какая аминокислота подвергается преимущественно внутримолекулярному дезаминированию?

а) ала; б) вал; в) тир; г) гис; д) орн.

7. В каких превращениях происходит образование аммиака в клетках?

а) H₂ + N₂ =; б) глу → α-кетоглутарат; в) глу → глн; г) глн → глу; д) АМФ → ИМФ.

8. Ферменты каких классов принимают участие в ЦСМ?

а) оксидоредуктазы; б) трансферазы; в) гидролазы; г) лиазы; д) изомеразы.

9. Атомы азота мочевины происходят из:

а) аммиака и аспартата; б) аммиака и аспарагина; в) аммиака и глутамата; г) глутамата и глутамина; д) глутамина и аспарагина?

10. Какие энзимопатии сопровождаются гипераммонемией?

а) цитруллинемия; б) гистидинемия; в) арининосукцинатурия; г) дефект карбамоилфосфатсинтетазы I; д) фруктозурия.

 

Лабораторная работа № 1. Количественное определение концентрации мочевины в сыворотке крови уреазным фенол/гипохлоритным методом.

Принцип метода. Мочевина под действием уреазы гидролизуется с обращением карбоната аммония. Ионы аммония реагируют в присутствии нитропруссида с фенолом и гипохлоритом, образуя окрашенный комплекс. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации мочевины в пробе.

Ход работы. Осуществляется в соответствии с таблицей 1.

Таблица 1

РЕАКТИВЫ	Опытная проба, мл	Калибровочная проба, мл
Рабочий реагент	1,0	1,0
Калибратор	-	0,01
Сыворотка крови	0,01	-

Реакционную смесь тщательно перемешивают и инкубируют не менее 5 минут при комнатной температуре (не ниже 20°C). После окончания инкубации во обе пробы вносят по 1 мл гипохлорита, инкубируют в термостате при 37°С в течение 15 минут; затем пробы охлаждают до комнатной температуры и измеряют оптическую плотность опытной и калибровочной проб против дистилированной воды в кюветах с длиной оптического пути 5 мм при длине волны 540 нм на фотоколориметре.

Примечание: Окраска проб стабильна в течение 5 - 8 часов.

Расчет концентрации мочевины в сыворотке крови проводят по формуле:

 

С = Еоп / Екал • 30 [мг/100мл]

или

C = Еоп / Екал • 5,0 [ммоль/л]

 

где: E_оп. – экстинкция опытной пробы;

E_кал. – экстинкции калибровочной пробы.

Норма. 10-50 мг/100 мл (1,7-8,3 ммоль/л)

Клинико-диагностическое значение. На долю мочевины приходится половина остаточного азота крови, именно та часть, которая в наибольшей степени задерживается в крови при нарушении функции почек. При патологии почек уровень мочевины в крови нарастает гораздо быстрее, чем остальных компонентов остаточного азота. К тому же определение уровня мочевины в крови технически проще осуществимо, чем остаточного азота. В связи с этим уровень ее в крови, прежде всего, характеризует экскреторную функцию почек.

Повышение содержания мочевины в крови отмечается у больных с другими патологическими состояниями – рефлекторной анурией, обструкцией (камни и злокачественные новообразования) в мочевыводящих путях, усиленным распадом белка (острая желтая атрофия печени, тяжелые инфекционные заболевания, обширные травмы и др.).

Верхняя граница содержания мочевины в сыворотке крови зависит от характера питания. При приеме белков в сутки свыше 2,5 г/кг веса уровень мочевины может возрастать до 10 ммоль/л.

Снижение уровня мочевины в крови наблюдается редко и отмечается обычно при дефиците белка в рационе. При беременности также возможно снижение концентрации мочевины в крови ниже 3,33 ммоль/л.

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.

 

Лабораторная работа № 2. Количественное определение мочевины в сыворотке крови и в моче диацетилмонооксимным методом

Принцип метода. Мочевина образует с диацетилмонооксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов трехвалентного железа комплекс красного цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию мочевины.

Меры предосторожности по ходу работы. Обращаться с осторожностью, т. к. реактив 2 содержит ядовитое вещество тиосемикарбазид, а в рабочем растворе содержится серная кислота.

Примечание: в настоящее время данный метод, как более токсичный и опасный, вытесняется уреазным фенол/гипохлоритным методом.

Ход работы. Осуществляется в соответствии с таблицей 1.

Таблица 1

Реагент	Проба	Эталон	Контр. раствор
Сыворотка или разведенная моча	0,01	-	-
Реактив 1	-	0,01	-
Дистиллированная вода	-	-	0,01
Реактив 2	2,0	2,0	2,0

В пробирку отмеривают 0,01 мл сыворотки крови или разведенной мочи, добавляют 2 мл рабочего раствора (реактива 2), содержащего смесь раствор диацетилмонооксима, тиосемикарбазида и хлорида железа в кислой среде.

Эталонную пробу обрабатывают точно так же, используя вместо 0,01 мл сыворотки крови 0,01 мл эталонного раствора мочевины (реактива 1).

Содержимое пробирок тщательно перемешивают, пробирки закрывают алюминиевой фольгой и помещают точно (!) на 10 мин в кипящую баню.

Затем пробирки быстро охлаждают в токе холодной воды и не позднее (!) 15 мин после охлаждения, измеряют оптическую плотность пробы (A₁) и эталона (A₂) против контрольного раствора (реактив 2) в кювете 10 мм при длине волны 490–540 нм (зеленый светофильтр).

Мочу перед анализом разводят дистиллированной водой в соотношении 1: 100, а результат умножается на коэффициент разведения.

Расчет:

[Мочевина] = 16,65(А₁/А₂)(моль/л).

 

Норма. 2,5–8,3 ммоль/л.

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагности­ческую оценку.

Предупреждение. При содержании мочевины в пробе свыше 23 ммоль/л пробу следует развести дистиллированной водой, анализ провести повторно, а полученный результат умножить на коэффициент разведения.

При определении мочевины в гемолитических или липемических сыворотках пробу необходимо депротеинировать 5 %-ным раствором ТХУ. Для этого в пробирке смешивают 0,1 мл пробы с 1 мл раствора ТХУ и центрифугируют. Точно так же разбавляют и эталонный раствор мочевины. Для собственно анализа отмеривают 0,1 мл надосадочной жидкости. Далее определение проводят как при анализе без депротеинирования. Таким же способом можно анализировать цельную кровь.

 

Рекомендуемая литература

Основная

1 Кухта, В.К и др. Биологическая химия: учебник / В.К. Кухта, Т.С. Морозкина, Э.И. Олецкий, А.Д. Таганович; под ред. А.Д. Тагановича. – Минск: Асар, М.: Издательство БИНОМ, 2008. – С. 277-287.

2 Биохимия: Учебник для вузов / Под ред. Е.С. Северина. – 4-е изд., испр. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. – С. 469-491.

3 Филиппович, Ю. Б. Основы биохимии. – 4-е изд. – М.: Агар, 1999. – С. 265-278

4 Николаев, А.Я. Биологическая химия. М.: Медицинское информационное агентство, 2004. – С. 335-351.

5 Марри Р. и др. Биохимия человека: в 2-х т.: Пер. с англ., М.: Мир, 2004. – Т.1: С. 306-316.

6 Березов, Т. Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. – М.: Медицина, 1998. – С. 428–451.

Занятие 21

Белки-3. Особенности обмена отдельных
аминокислот в норме и при патологии

Цель занятия: сформировать представления об особенностях обмена отдельных аминокислот (АК) в норме и при патологии. Дать биохимическое обоснование практического применения аминокислот в медицине. Освоить методику определения активности трансаминаз в сыворотке крови.

 

Структура занятия

Теоретическая часть

1.1 ЦТК (реакции, ферменты, коферменты, механизмы регуляции, биологическая роль). Пути вступления отдельных АК в ЦТК (глико- и кетогенные АК).

1.2 Особенности обмена отдельных АК – биосинтез и распад, участие в ГНГ или кетогенезе, применение в медицине.

1.3 ала – основные пути метаболизма, регуляторная роль.

1.4 гли, сер – механизм взаимопревращений, роль ТГФК в обмене, участие в биосинтезе фосфолипидов, этаноламина, холина, пуринов, порфиринов, глутатиона, креатина, гиппуровой кислоты, желчных кислот. Нарушение обмена гли – гиперглицинемия, оксалоз, их основные клинические проявления.

1.5 глу – прямое и непрямое окислительное дезаминирование, трансаминирование, ферменты и биологическое значение. Биологическое значение глутаматдегидрогеназы.

1.5.1 Адаптивная роль глу: антигипоксическая – образование γ‑аминомасляной кислоты (ГАМК), γ-оксимасляной кислоты (ГОМК) и янтарной кислоты, энергетический “выход” окисления глу, антитоксическая – обезвреживание аммиака, связывание тяжелых металлов и др., антиоксидантная – синтез глутатиона. биосинтез про, пуриновых оснований. Роль глу в интеграции углеводного, липидного и азотистого обменов. Показания к применению глу в медицинской практике.

1.6 асп – основные метаболические превращения: трансаминирование, амидирование (обезвреживание аммиака), α-декарбоксилирование (биологическая роль b-аланина), биосинтез пуриновых и пиримидиновых оснований, биосинтез мочевины, участие в цикле пуриновых нуклеотидов. Показания к применению асп в медицинской практике.

1.7 про – биосинтез, распад, механизм образования о-про, реакция, ферменты, роль микросомального окисления, аскорбата и др. Клинико-диагностическое значение определения содержания про и о-про в крови и моче. Нарушение обмена про – гиперпролинемия, основные клинические проявления.

1.8 гис – биосинтез и основные пути обмена, их биологическая роль: образование гистамина, дипептидов ансерина, карнозина. Использование гис как радиопротектора и антиоксиданта. Нарушение обмена гис – гипергистидинемия, основные клинические проявления.

1.9 арг – биосинтез и основные пути обмена, их биологическое значение: адаптивная роль системы арг – аргиназа – мочевина.

1.10 цис – механизм биосинтеза из мет. Антитоксическая, антиоксидантная и радиопротекторная роль: биосинтез цистина, таурина, ФАФС, глутатиона и др. Нарушение обмена цис – цистиноз, его основные клинические проявления.

1.11 мет – основные пути метаболизма: образование S -аденозилметиони­на (SAM), витамина U (S -метилметионина), реакции трансметилирования – синтез холина, адреналина, креатинина, реакции детоксикации и др. Нарушение обмена мет – гомоцистинурия, цистатионурия, основные клинические проявления.

1.12 фен и тир – основные пути метаболизма: биосинтез катехоламинов, тиреоидных гормонов, меланина и др. Нарушение обмена фен, тир – фенилкетонурия, альбинизм, алкаптонурия, тирозиноз, их основные клинические проявления.

1.13 трп – основные пути обмена: кинурениновый, образование триптамина и серотонина. Нарушения обмена трп – синдром Хартнупа, его основные клинические проявления.

1.14 вал, лей, иле – особенности обмена, регуляторная роль этих аминокислот. Нарушения обмена – болезнь кленового сиропа, ее основные клинические проявления.

1.15 Интеграция углеводного, липидного и белкового обменов, механизм образования общих метаболитов.

 

Практическая часть

2.1 Решение задач.

2.2 Лабораторная работа.

 

Задачи

1. При декарбоксилировании какой аминокислоты образуется β-аланин?

а) α-аланина; б) глутамина; в) метионина; г) фенилаланина; д) аспартата.

2. В образовании каких веществ принимает участие серин?

а) этаноламина; б) этанола; в) холина; г) пирувата; д) глюкозы.

3. Активная форма какого витамина выступает коферментом взаимопревращения глицина и серина?

а) В₁; б) В₂; в) В₃; г) В₆; д) В₉.

4. Укажите промежуточные метаболиты превращения глутамата в сукцинат:

а) α-кетоглутарат; б) γ-аминобутират; в) γ-оксибутират; г) янтарный полуальдегид; д) сукцинилкоэнзим А?

5. В синтезе каких веществ принимает участие гистидин?

а) ансерина; б) гистамина; в) триптофана; г) карнозина; д) карнитина.

6. C каким субстратом взаимодействует NO-синтаза?

а) аланином; б) аргинином; в) NO; г) цитруллином; д) орнитином.

7. В процессе метаболизма триптофана образуются:

а) аланин; б) тиамин; в) серотонин; г) секретин; д) кинуренин?

8. Для метилирования каких соединений используется SAM?

а) креатина; б) гуанидиноацетата; в) норадреналина; г) метионина; д) фосфатидилэтаноламина.

9. Первой стадией катаболизма АКРР является:

а) декарбоксилирование; б) фосфорилирование; в) трансаминирование; г) дезаминирование; д) гидроксилирование?

10. Сколько молекул АТФ можно синтезировать по результатам превращения валина в щавелевоуксусную кислоту?

а) 10; б) 12; в) 15; г) 16; д) 20.

Лабораторная работа

Лабораторная работа № 1. Определение активности АСТ (аспартат­аминотрансферазы) в сыворотке крови по Райтману и Френкелю

Принцип метода. В результате переаминирования, происходящего под действием АСТ, образуется щавелевоуксусная кислота. Щавелевоуксусная кислота спонтанно декарбоксилируется в пировиноградную. При добавлении 2,4-динитрофенилгидразина в щелочной среде образуется гидразон пировиноградной кислоты красно-коричневого цвета, интенсивность окраски которого определяется колориметрически (см. уравнения).

 

 

Ход работы. Пробирку с 0,25 мл субстратно-буферной смеси нагревают в термостате при 37°C в течение 5 мин, добавляют 0,05 мл сыворотки крови и инкубируют 60 мин в термостате при этой же температуре.

Добавляют 0,25 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина и выдерживают в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем добавляют еще 2,5 мл NaOH, перемешивают и оставляют еще на 10 мин при комнатной температуре.

Измеряют на фотометре экстинкцию опытной пробы при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве контрольной пробы используется дистиллированная вода.

Расчет. Производят по калибровочному графику.

Норма. АСТ – 0,1–0,45 ммоль/ч.л (пирувата на 1 л сыворотки крови за 1 час инкубации при 37°С).

Клинико-диагностическое значение. Определение активности АЛТ и АСТ широко используется в ранней дифференциальной диагностике различных заболеваний. Оба фермента высокоактивны в различных тканях. Однако наибольшая активность АЛТ приходится на печень, а АСТ – на миокард. В связи с высокой информативностью определение активности АЛТ используется для ранней диагностики болезни Боткина (до появления желтухи и первых симптомов болезни – недомогания, слабости и т. д.), а также ее безжелтушных форм. Высокая активность фермента в крови поддерживается первые 10–15 дней, а затем постепенно снижается. Степень увеличения активности АЛТ коррелирует с тяжестью болезни.

АСТ более специфична для миокарда, поэтому используется для ранней дифференциальной диагностики инфаркта миокарда. Причем увеличение активности отмечается через 24–36 часов и снижается на 3–7-е сутки.

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.

 

Лабораторная работа № 2. Определение активности АЛТ (аланинаминотрансферазы) в сыворотке и плазме крови ферментативным методом (УФ-области)

 

Принцип метода. Основан на сопряжении двух ферментативных реакций (АЛТ и ЛДГ) – трансаминирования и последующего NADH-зависимого восстановлении пирувата, образующегося в процессе трансаминирования.

I этап:

АЛТ

L-ала + a-кетоглутарат ¾® пируват + L-глу;

 

II этап:

ЛДГ

пируват + NADH+H⁺ ¾¾¾¾® L-лактат + NAD⁺.

 

Ход реакции регистрируют по убыли восстановленной формы кофермента – NADH+Н⁺, имеющего максимум поглощения при 340 нм.

Ход работы. Активность АЛТ в сыворотке крови определяют в 2 этапа.

I этап. В пробирку вносят 1 мл раствора № 1 (смесь ЛДГ, NADH+Н⁺ буфер-субстрата, пиридоксаль-фосфата) и 0,1 мл сыворотки крови, перемешивают и термостатируют 5 мин при 37 °C.

II этап. Содержимое пробирки переливают в кювету, предварительно нагретую до 37 °C, и добавляют 0,1 мл раствора № 2 (a-кетоглутарат).

Измеряют оптическую плотность при длине волны 340 нм, ширине кюветы 10 мм, в интервале 3 мин.

Расчет. Вычисляют изменение экстинкции за 1 мин (DА/Dt) в мккат/л, а также каталитическую концентрацию (активность АЛТ) по формуле

С = D A/ D t ´ 31,75.

Норма. Активность АЛТ сыворотки крови равна 0,15–0,96 мккат/л.

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагности­ческую оценку.

 

Рекомендуемая литература

Основная

1 Кухта, В.К и др. Биологическая химия: учебник / В.К. Кухта, Т.С. Морозкина, Э.И. Олецкий, А.Д. Таганович; под ред. А.Д. Тагановича. – Минск: Асар, М.: Издательство БИНОМ, 2008. – С. 288-303.

2 Биохимия: Учебник для вузов / Под ред. Е.С. Северина. – 4-е изд., испр. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. – С. 491-520.

3 Николаев, А.Я. Биологическая химия. М.: Медицинское информационное агентство, 2004. – С. 351-365.

4 Марри Р. и др. Биохимия человека: в 2-х т.: Пер. с англ., М.: Мир, 2004. – Т.1: С. 317-355.

5 Березов, Т. Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. – М.: Медицина, 1998. – С. 451–468.

Дополительная

6 Ленинджер А. Основы биохимии. М.: Мир, 1985. Т. 2. С. 653–681.

 

 

Занятие 22

Белки-4. Нуклеопротеиды. Структура и функции информационных макромолекул

Цель занятия: сформировать представления о структуре, метаболизме и функциях азотистых оснований, нуклеотидов и нуклеиновых кислот. Освоить качественные реакции на продукты гидролиза нуклеопротеидов.

 

Структура занятия

Теоретическая часть

1.1 Переваривание и всасывание нуклеопротеидов в ЖКТ. Характеристика и функции “ядерных” белков.

1.2 Мононуклеотиды как структурные компоненты нуклеиновых кислот (НК), их основные функции:

1.2.1 переносчики энергии – АТФ, ГТФ.

1.2.2 коферменты – NAD, NADP, FAD, FMN.

1.2.3 участие в метаболизме углеводов (УДФ-глюкоза и др.)