Клеточные линии: ограниченные и постоянные;особенности и проверка развития нормальных, трансформированных и опухолевых к-к.

После нескольких пересевов линия клеток либо гибнет (ограниченная линия клеток), либо «трансформируется» и становится постоянной клеточной линией. Не всегда ясно, возникают стволовые клетки постоянной культуры в ходе пассирования, или они предсуществуют в замаскированной форме в популяции клеток ограниченной линии. Различия в свойствах этих клеток и*большой период времени, предшествующий их появлению (иногда несколько месяцев), позволяют предположить мутационную природу их появления (хромосомные перестройки, транслокации, частичное или полное неспаривание или точечные мутации). Нельзя исключить и возможность предсуществования «бессмертных» клеток, особенно в культурах, полученных из опухолей. Появление постоянной линии клеток констатируется по морфологическим изменениям (уменьшение размера клеток, снижение их адгезивности, округление и увеличение ядерно/цитоплазматического отношения), по увеличению скорости роста (время удвоения клеток в культуре снижается с 36—48 до 12— 36 ч), по снижению зависимости от сыворотки, по увеличению эффективности клонирования, по снижению зависимости от субстрата (способность пролиферировать в суспензии вырастает так же, как и формирование клонов в агаре), по увеличению гетероплоидности (хромосомные различия между клетками) и анеуплоидности (отличие от донорского эуплоидного кариотипа) и по увеличению опухолеродности. Черты сходства между спонтанной трансформацией in vitro и злокачественной трансформацией очевидны, но тем не менее нельзя считать эти два процесса идентичными. Нормальные клетки могут трансформироваться в постоянную линию, не становясь при этом злокачественными; из злокачественных опухолей можно получить культуры, которые трансформируются и приобретают указанные выше признаки и при этом становятся более, а иногда менее опухолеродными.

Преимущ. постоянных линий клеток: высокая скорость роста, возможность достижения более высокой плотности, а следовательно, и большего выхода биомассы, их меньшая зависимость от сыворотки и возможность поддержания в более простых средах, а также их способность к росту в суспензии. Недостатки: повышенная хромосомная нестабильность, отклонение от фенотипа донора и утрата специфических тканевых маркеров.

 

Клеточный цикл и цикл роста

–послед-ть событий,кот привод.к удвоен.компон-ов к-ки(к дел-ю).

Митоз(М)– G1 промеж-й период до репликац ДНК–S-периoд репл.ДНК– G2 2-ой промеж.период.м-ду реплик и начал.митоза. В метафазе к-ки в форме шара,слабо прикрепл к субструту,легко отдел-ся всрях-ем или р-ром трипсина. Фазы:1) лаг-фаза 2)экспоненциального роста (достиг.монослоя)3)замедленного роста(стационарная фаза)4)фаза снижения кол-ва и гибели кл-к.

Метафаза: кл-ки приним.форму, слабо прикрепл. к субстрату,их легко отделить встряхиванием или трипсинизацией. К-ки дел-ся 1 раз каждые 24 ч. Кол-во кл-к удваивается ч-з правил.е промеж.времени–на стадии экспоненциального роста. После экспоненциального роста 1 из факторов стан-ся лимит-м(в результ.истощ.я фактора среды или кл-ки полн-тью. покроют поверх-ть, на кот.растут).Скорость роста замедляется.Делен. кл-к прекращ.– стационарная фаза.

При восстановлении лимитирующего фактора кл-ки возвр-ся в фазу G1 кл.цикла, происх.с-з ДНК–кл-ка делится. К-ки животных прекращ-т продвиж-е по кл. циклу после митоза–для стимуляции первичной кл. культуры, устран-т ограничение роста. В суспензии кл-ки поддерж-т экспоненциальный рост бесконечно(культивир-е в хемостате). Синхронизация клеток–получ-е кл-к нах-ся в одинак. фазе роста. 2 сп-ба:

1) Хим-я или физиол-я блокировка кл. цикла т.о., чтобы кл-ки накоп-сь на к-либо 1 стадии цикла. недостаток: кл-ки подверг-ся неблагоп.возд. и стан-ся аномальными.

2) Отобр.кл-ки, наход-ся на опред.стадии кл. цикла. Отбор на основании:

-физических св-в (слабое прикрепл.кл-к к субстрату, разл.сод-е ДНК в кл-х). -химических свойств, вызывая избират-ю ги-

бель остающихся кл-к.

В основе м-да избират. гибели кл-к лежит гибель кл-к в опред. фазе кл. цикла– приводит к избират.отбору кл-к, наход-ся вне фазы-мишени.

 

 

44. Оптимизация состава пит-х сред для культур живот. кл-к в 2-х направл-х: 1)Разраб-ка сред, треб-х внесения природ. добавок (сыворотки, эмбриональные экстракты и др.), 2)созд-е сред хим. опред-го состава. Широко примен. среды, сод-щие источники энергии (углеводы) и азота; незамен.аминокислоты; витамины; неорг.соли – источники макро- и микроэлементов; нуклеозиды; жиры и жирораств. компоненты; гормоны; ростовые, а также сыворотку (до 10 %) и некот.др. добавки (бактопептон и т. п.). В 40−50-е гг. больш.часть кл-к выращивалась в плазме или на фибриногеновом сгустке в присут. тканевых экстрактов или их ультрафильтратов. Начиная со среды 199, предлож-й Г. Моргоном в 1950 г. и сод-щей более 60 синтет-х ингредиентов, широко осущ.подбор состава и методов пригот.разл.х пит.сред. Х.Игл в 1955 г. исследовал потреб-ти клет. линий мышей L и HeLa в пит.в-вах. Х. Игл использовал среды опред. состава сод. смесь аминокислот, витаминов, солей и углеводов, и небол.кол-во сыворотки лошади или человека. 27 факторов были определены как незаменимыедля роста. Они составили основу «базальной среды Игла», или БСИ. Из 20 аминокислот 13 оказались незаменимыми, а остальные 6 могли быть синтезированы кл-ми из др-х источ-в углерода. Удаление любого из 7 витаминов приводило к развитию симптомов недостаточности. Т.о. Х. Игл продемонстрировал пит.потребности кл-к мыши и человека.

 

 

45-46.

Культур. среда должна обеспеч. все внеш. условия, кот. кл-ки имели in vivo. Это обеспечивает выживание клеток, их пролиферацию и дифференцировку. Среда должна обеспеч. кл-ки пит. и гормон. факторами. Основу пит. сред сост.солевые р-ры. Мин.комп-ты,чтобы р-р выполн-л буферные функц., поддерж.постоян. кислотнощелочной баланс.. Постоянство рН –1 из главн. условий. Исп-ся солевые р-ры Эрла и Хенкса. Эти р-ры, как и фосфатносолевой буфер Дульбекко и Фогта исп-тся также для орошения и промывки кл-к при пассировании культур, выдел.кл.-х линий и др. манипул. Другим важн.условием яв-ся осмотич. давление. (опред-ся числом молей осмотически активных ч-ц раств-х в-в на 1 кг раств-я (осмоляльность) или на 1 л.р-ра (осмолярность). Диапазоны рН и осмоляльности узки и варьируют в зависимости от типа клеток..Для поддержания рН используется бикарбонатный буфер, HEPES 4-(2-оксиэтил)1-пиперазинэтансульфоновая кислота. Среды Игла MEM(сод. мин.в-ва, аминокислоты (13 незаменимых), 6 водорастворимых витаминов, холин и инозит, выполняющие роль углеводородного субстрата. МЕМ используется только с сывороткой, т.к. в ней отсут. биотин, витамин В12, ионы железа и микроэлементы. Основа– р-р Эрла.Среда Дульбекко DME или DMEM (двойная модификация среды Игла).для культ-я кл-к разл. типов, в т.ч. нетрансформированных и гибридом. Явл-ся основой для бессыворот-х сред. Сод. двойную конц. аминокислот, глицин, серин, пируват, железо. При испол. среды необх.инкубатор с 10% СО2. Среда Искова IMDM - модификация среда Дульбекко. Добавлены незамен.аминокис-ты, биотин, витамин В12, селенит натрия. Введен HEPES и уменьш. NaCl и NaHCO3. Среда бессыворот., испол.для культ.лимфоцитов и кроветворных кл-к. Среда МакКоя 5А и серия сред RPMI. Обычно производится в модификации Ивката и Грейса (RPMI) и предназн.для культ. лейкоцитов в присут. сыворотки, примен-ся и для культ-я гибридом. Концентрация СО2 5%. Среда 199 Ей характ широк. спектр пит.в-тв и невысок.их конц-я. Исп-ся без добавок,, а с сывороткой как ростовая среда для быстро размножающихся клеток. Бессыворот.среды – среды узко специализированы,К базовой среде добавл-ся инсулин, трансферрин, гидрокортизон или его аналог дексаметазон и т.д. Преимущества: улучшение воспроизводимости результатов опыта вследствие большей стабильности состава среды; 2)снижение риска заражения культуры вирусами, грибами, микоплазмой; 3)облегчение очистки продуктов клеточного метаболизма; 4)снижение влияния дополнительных белков на результаты биологических исследований; 5)отсутствие цитотоксичности сыворотки. Недостатки: 1)для бол-ва тканей сыворотка не явл-ся физиол.жидкостью,2) сыворотка может быть цитотоксичной, т.к. сод. полиаминоксидазу, действ. на полиамины (спермин, спермидин), явл-ся продуктом секреции быстро пролиферирующих клеток (эмбриональная сыворотка содержит относительно много такого фермента); 3) вариабельность состава сывороток разн. партий; 4)могут сод. недост.кол-во специфич. ростовых факторов,и их необх. добавить.

 

 

47.

Сыворотка –сложн. смесь мелк. и крупн. молекул, способ-х вызывать и тормозить рост клеток. Функции:1)обеспеч. гормон. факторами, стимул. рост кл-к и их функции; 2)обеспеч. факторами прикрепл-я и распластывания кл-к; 3)обеспечение транспортными белками, переносящими гормоны, минеральные вещества, липиды и т.д. Белки сыворотки, прямо и специфически участ-щие в стимуляции кл. деления наз-ся– факторы роста. Один и тот же тип клеток может быть стимулирован различными ростовыми факторами. Фибробласты размн-ся в ответ на фактор роста фибробластов, фактор роста эпидермиса, фактор роста, синтез-мый тромбоцитами и соматомедины. Эти в-ва явл.(стимулируют митоз. Др. важн.фактором роста явл. гормон инсулин. примен-тся глюкокортикоиды (гидрокортизон, дексаметазон), стероиды (эстрадиол, тестостерон, прогестерон) и гормоны щитовидной железы (трииодтиронин). Гормоны стимул. или подавляют рост в завис.ти от типа кл-ок и их плотности. Для переноса низкомол. факторов (витаминов, аминокислот, липидов и других) необх. транспортные белки(альбумин). Транспорт железа обеспеч.т трансферрин, а поверхность больш-ва культ-х клеток сод. рецепторы для этого белка. К факторам прикрепления и распластывания клеток относ. коллаген и фибронектин, более специализированы хондронектин (адгезия хондроцитов) и ламинин (адгезия эпителиальных клеток).

48.

Кл-ки, получ-е от животного,до 1-го пересева – первичные. Такие кл-ки гетерогенны и хар-ся малым пролиферативным пулом, в них предст-ны типы кл-к той ткани, откуда они были получены и обнаруж-ся экспрессия св-в, присущих данн. ткани. Однако первич.кул-ра лишена многих к-к, присут-х в исходной ткани, т.к.у не все кл-ки

прикреп-ся к субстрату и выж-т в условиях in vitro. Первич.кул-ры к-к получ. путем стерильного удал-я фрагм-та ткани и его механической (фрагм-т ткани измельч. до размеров ок.1 мм, кот. прикреп-ся к субстрату благод. собств. адгезивности, поверхности субстрата или сгустку плазмы) или ферментативной дезагрегации(высок. выход кл-к, испол.коллагеназы–снижение размера экспланта до небол. кластера кл-к, кот.прикрепл. к субстрату и распластывается). Некот.время кл-ки экспоненциально размн., затем ч-з 6 мес. скорость роста сниж., а ч-з 10 мес.кл-ки деградируют и погиб. Так набл-ся после 20−50 генераций.На ран. стадиях кл-ки ост-ся эуплоидными, т. е. облад. правил. диплоидным набором хромосом, а позднее – стан-ся анеуплоидными. В некот. случ. анеуплоидные кл-ки выжив. и продолж.размн-ся. Частоту трансформаций можн.увелич., обработав кл-ки мутагенами или некот.вирусами. К-ки необх.период-ки пересевать,это обеспеч.т продление сущ-я культуры, клонирования, исследования и сохр-я к-к, получ.однородных популяций. После неск-х пересевов линия к-к либо гибнет (ограниченная линия к-к), либо трансформ-ся и стан-ся постоянной кл. линией. Появление пост. линии к-к констатируется по морфол.измен-м (уменьш. размера к-к, сниж.их адгезивности, округление, увелич. ядерно-цитоплазматического соотнош-я), по увелич. скорости роста (время удвоения к-к сниж-ся в 1,5−3), по сниж-ю зависимости от сыворотки и возмож-ти поддержания в более простых средах, по сниж-ю зависимости от субстрата и, их способ-ти к росту в суспензии; по увелич-ю гетероплоидности и анеуплоидности, по увелич. опухолеродности. Однако норм-е к-ки, спонтанно трансформируясь в пост. линию, не стан-ся при этом злокачест-ми (несмотря на некот. черты сходства). Постоян.кл. линии имеют преимущ: высок. скорость роста, возмож-ть достиж-ия более высок. плотности и высокого выхода биомассы;

 

50)культивирование жив. Кл. на микроносителях.

Сочетать положительные стороны монослойного и суспензионного

культивирования позволяет использование системы с микроносителями.

Микроносители – мелкие твердые частицы (поддерживаемые в суспен-

зии благодаря перемешиванию), на поверхности которых клетки растут в

виде монослоя. Использование микроносителей дает клеткам, обладаю-

щим адгезивными свойствами, все преимущества крупномасштабных

суспензионных культур.

Микроносители должны быть нетоксичными, не сорбировать компо-

ненты питательных сред и продукты метаболизма клеток, а также иметь

поверхностный заряд или обменную емкость, достаточную для прикреп-

ления клеток. Коммерческие микроносители имеют диаметр

100−200 мкм и подразделяются на 6 основных групп:

1) декстрановые микроносители, поперечно сшитые, типа Cytodex 1;

2) декстрановые микроносители типа Cytodex 2;

3) микроносители, покрытые коллагеном или желатином, типа

Cytodex 3;

4) полистиреновые микроносители типа Biosilon, Cytospheres;

5) стеклянные микроносители типа Bioglass;

6) целлюлозные микроносители типа ДЕ-53.

Используемые в настоящее время микроносители на основе микро-

пористого желатина или пористого боросиликатного стекла имеют ем-

кость около 3000 клеток/микроноситель.

 

 

51)типы культуральных систем для непрочных культур жив. Кл.

Непроточные культуры. Обычный тип культур, в котором клетки

вводят в фиксированный объем среды. Эти системы пригодны для куль-

тивирования клеток как в монослое, так и в суспензии. По мере роста

клеток в среде культивирования происходит использование питательных

веществ и накопление метаболитов – следовательно, среда должна по-

стоянно меняться, что, в свою очередь, приводит к изменению клеточно-

го метаболизма (физиологической дифференцировке). Системы непро-

точных культур характеризуются в той или иной степени накоплением

отходов и непостоянством внешних условий.

Способы увеличения продолжительности жизни культур:

а) прерывистый – часть культуры заменяется равным объемом све-

жей среды;

б) постоянный – объем культуры постоянно увеличивается с низкой

скоростью, а небольшие порции клеток периодически удаляются;

в) перфузионный – постоянное поступление свежей среды в культуру

и одновременное удаление равного объема использованной бесклеточ-

ной среды.

 

52)отличительные особенности кльтив. кл. безпозвоночных и позвоночных жив.

В настоящее время известно около 150 перевиваемых линий клеток

беспозвоночных, наибольшее число из которых получено от насекомых.

Среды для культивирования клеток и тканей насекомых сильно варьи-

руют по составу. При составлении питательных сред часто руководствуют-

ся данными по составу гемолимфы, различающейся у разных видов насе-

комых. В настоящее время предложено более 50 вариантов питательных

сред для культивирования клеток беспозвоночных. Все эти среды отлича-

ются от сред для клеток млекопитающих наличием органических кислот,

повышенным содержанием аминокислот и более высоким осмотическим

давлением. Ни одна из этих сред не пригодна для получения культур кле-

ток всех видов беспозвоночных, т. е. не является универсальной.

Для получения культур клеток насекомых часто берут эмбриональ-

ные клетки. Первичные культуры служат источником для получения

длительно пересеваемых линий клеток беспозвоночных. С помощью ме-

тодов первичного культивирования клеток удается исследовать диффе-

ренцировку и метаболизм клеток беспозвоночных в культуре.

После длительного периода адаптации клеток к условиям культиви-

рования удается проводить пересев клеток. Обычно период адаптации

занимает 3−10 месяцев от момента эксплантации клеток в первичную

культуру. В настоящее время получен целый ряд пересеваемых линий

клеток из различных тканей, взятых на разных стадиях развития беспо-

звоночных животных.

Культуры клеток беспозвоночных животных представляют огромный

интерес для изучения молекулярных механизмов взаимодействия хозя-

ин − паразит, роли мобильных генетических элементов в адаптации бес-

позвоночных к стрессовым ситуациям окружающей среды, регуляции

действия генов в клетках высших организмов и клеточных механизмов

дифференцировки и т. д.