Молочнокислые бактерии и фаги в нестабильных

Творог брожений

Диссертация

к

Получение академической степени одного

Доктора наук

- DR. rer. nat. -

В области биологии / химии

в

Бременский Университет

Представлено

Christiane Б. Горбун

Бремен 2002

Page 2

Рецензенты: Профессор Д-Р Дитмар Blohm

Рецензенты: Д-Р Хорст Neve

День продвижение коллоквиум:

Декабрь 2002

Page 3

Для Фрэнка Оливера, Патрик

и

Моя семья

Page 4

Оглавление

1. EINLEITUNG...................................................................................................................... 1

1.1. Биотехнологических продуктов путем ферментации отделка........................................... 1

1.2. ДНК-аналитика в молокоперерабатывающей промышленности - настоящее и будущее........... 2

1.2.1. Организмы идентификации посредством флуоресцентной in situ гибридизации.................... 4

1.2.2. Молекулярно-биологические аспекты при производстве кисломолочного изделия.. 5

1.2.3. Одновременное Genanalyse через ДНК-чип-технологии............................................ 7

1.3. Причины неадекватного брожений.................................................................................. 9

1.3.1. Бактериальные Загрязнения................................................................................... 9

1.3.2. Потери от соответствующих брожения, Плазмиды карты памяти характеристики............... 10

1.3.3. Фаги-условное начало лизиса культуры-вида................................................... 18

1.4. Цель Arbeit............................................................................................................... 21

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ..................................................................................... 22

2.1. Решения и Puffer..................................................................................................... 22

2.2. СМИ и Stamm haltung........................................................................................... 22

2.3. Молекулярно-Биологическое Обеспечение....................................................................................23

2.4. Oligonukleotide.............................................................................................................25

2.4.1. Зонды для детекции бактерий с помощью FISH........................................... 25

2.4.2. Oligonukleotide фаги для гены устойчивости.............................................................. 26

2.4.3. Oligonukleotide для гены цитрата и лактозы веществ..................... 30

2.4.4. Oligonukleotide для выявления Lactococcus -фаги................................ 31

2.4.5. Зондов для ДНК-чип-гибридизации............................................................. 33

2.5. Probe Material..............................................................................................................34

2.5.1. Стартовых культур и отдельных штаммов культуры производителя.................................... 34

2.5.2. Брожение начальный культуры Probat 8/0 с нормальным и нарушенным образцы

Окисление................................................................................................................. 35

2.5.3. Кварк образцы других производителей.............................................................................. 35

2.5.4. Эталонные штаммы BAfM и DSMZ........................................................... 36

2.5.5. Bakteriophagen.......................................................................................................36

2.6. Флуоресцентная in situ -гибридизации грам-положительных бактерий............................. 37

2.6.1. Фиксация клеток из образцов Творога.................................................................. 37

2.6.2. Ферментную выщелачивание при грам-положительных бактерий...................................... 37

2.6.3. Einzel Zell hybridisierung.........................................................................................38

2.6.4. Общее определение количества клеток с DAPI................................................................... 38

2.6.5. Детекция результатов Гибридизации............................................................... 39

2.7. PCR-amplifikat ionen...................................................................................................39

2.7.1. Probe Aufarbeitung.................................................................................................39

2.7.2. Специфическая выявления Lactococcus генов.................................................... 40

2.7.3. Выявления Lactococcus -фаги 936, P335 - и с2 - вида.......... 40

2.7.4. Agarose gelelektrophorese.......................................................................................40

2.7.5. Последовательность анализа ПЦР-ДНК Кейт.................................................................... 41

2.8. ДНК-последовательность анализа фаги P482....................................................................... 41

2.8.1. Добыча фаги в масштаб заготовил.................................................. 41

2.8.2. Секвенирование фаги P482............................................................................ 42

2.8.3. Сравнительный анализ ДНК................................................................................. 42

2.9. DNA-Chip-Hybridisierung...........................................................................................43

2.9.1. Подготовка и подключение зондов на поверхности Чипа.......................... 43

2.9.2. Добыча и ограничения геномной ДНК................................................ 43

2.9.3. DNA-markierung methoden..................................................................................44

2.9.4. (Пред-)гибридизация микро массивы.................................................................... 46

Page 5

3. ERGEBNISSE.................................................................................................................... 48

3.1. Демографического анализа с флуоресцентной in situ гибридизации........................................ 48

3.1.1. Проницаемость LowGC грам-положительной клеточной стенки и флуоресценции

ферментированный молочные продукты................................................................................... 48

3.1.2. Фаги титр, метаболически активные клетки окисление и изменение........................... 48

3.1.3. Состав популяции бактерий........................................................... 50

3.2. Фаги резистентности у Lactococcus lactis........................................................................ 53

3.2.1. Фаги генов резистентности в стартовых культур.................................................................. 53

3.2.2. Фаги генов резистентности в различных обеденном кварки............................................. 55

3.2.3. Последовательность сходства известных фаги генов устойчивости................................... 57

3.2.4. Фаги резистентности в брожений с различной раздражающий..................... 58

3.2.5. Сравнение фаги ген RAPD анализа результатов................ 61

3.3. Цитрат обмена веществ и ароматизаторов............................................................................. 64

3.3.1. Сравнение различных стартовых культур................................................................ 64

3.3.2. Цитрат метаболических генов в начальный культуры Probat 8/0 и во время

Брожения........................................................................................................... 65

3.4. Фаги вида и фаги титры в "Mixed Strain"-культур........................................ 66

3.4.1. Пределом обнаружения фаги ДНК при ПЦР-анализа...................................... 66

3.4.2. Фаги определение титра методом ПЦР по сравнению с определением по

Plaque-Tests............................................................................................................67

3.4.3. Фаги анализ стартовых культур.......................................................................... 68

3.4.4. Фаги нагрузки в бродильной пробы.............................................................. 69

3.5. Последовательность анализа фаги P482................................................................................. 70

3.5.1. Нуклеотидные последовательности фаги P482....................................................................... 70

3.5.2. Генетические элементы фаги P482.................................................................. 72

3.5.2.1 Open Reading Frames...................................................................................... 72

3.5.2.2 Promo Toren.......................................................................................................77

3.5.2.3 termina Toren....................................................................................................78

3.5.2.4 структуры Сигнала............................................................................................... 79

3.5.2.5 гены для tRNAs................................................................................................ 83

3.5.3. Сходство в ДНК других Lactococcus -фаги........................................... 85

3.5.4. Анализ P482 специфических "Open Reading Frames"....................................... 88

3.5.5. Функциональный анализ фаги генома............................................................... 90

3.6. Подготовительные работы к ДНК-чип-гибридизации................................................................. 92

3.6.1. Метка ставки на ПЦР, ник Translation и "random primed labelling"...... 92

4. ОБСУЖДЕНИЕ.................................................................................................................... 94

4.1. Бактерии в популяции неустойчивы säuernden брожения.............................. 94

4.2. Влияние свойств исходной культуры брожения...................................... 97

4.2.1. Phagen resistenz Gene...............................................................................................97

4.2.2. Окисление свойства и образование ароматических компонентов.......................... 103

4.3. Фаги вида в стартовых культур и бродильной пробы...................................... 106

4.4. Сравнительный геномный анализ на примере фаги P482.................................... 108

4.4.1. Методические аспекты при определении нуклеотидной последовательности, cos-Сайт и

Зачетно............................................................................................................ 108

4.4.2. Функция сопоставления гипотетических протеинов фаги P482........... 111

4.4.3. Модульный теория фаги эволюции.......................................................... 120

4.5. Аспекты выделения геномной ДНК для чип-гибридизации................ 122

5. ZUSAMMENFASSUNG................................................................................................. 125

6. ЛИТЕРАТУРА................................................................................................................... 127

7. ПРИЛОЖЕНИЕ......................................................................................................................... 149

Page 6

Список сокращений

BAfM федеральный институт исследования Молока, Киль

биовар. Biovariation

ВР

Пар оснований

БСА бычий сывороточный альбумин

КТ 5,(6)-карбокси Тетра метил родамина-N-гидрокси succinimide эфира

Cy3 5,5'-Disulfo-1,1'-(γ-карбо pentynyl)-3,3,3',3'-tetramethylindolo-

carbocyanin-N-гидрокси succimid эфира

DAPI 4',6-Diamidino-2-фенил-индол-дигидрохлорида

ДМСО диметилсульфоксид

DTT Dithiothreitol

рДНК дезоксирибонуклеиновая кислота рибосомная

dNTP дезокси трифосфата нуклеозида

ds

дважды strängig

DSMZ немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур GmbH

ЭБИ Европейского института биоинформатики институты

ЭДТА этилендиамин tetraacetic

EMBL European Molecular Biology Laboratory, Хайдельберг

FISH-флуоресцентная in situ гибридизации

FLUOS 5(6)-Carboxyfluorescein-N-гидрокси succinimide эфира

G+C Mol% гуанина и цитозина

ГУСАР Хайдельберг Unix Sequence Analysis Resources, Heidelberg

Л.

Lactococcus

ЛБ.

Lactobacillus

Лек. Leuconostoc

Л-л ЛДГ-лактатдегидрогеназа

NCBI-Национальный центр биотехнологической информации

Оптическая плотность OD

ORF-Open Reading Frame

OT предметных

PBS фосфатный буферный физиологический раствор

ПЦР полимеразной цепной реакции

ПФУ plaque forming units

Page 7

рРНК рибосомной рибонуклеиновой кислоты

rpm-Rounds per minute.

SDS сульфат натрия додециловый

SSC Standard засоленных Цитрат

Str.

Streptococcus

ТАМРЕ 5,(6)-карбокси Тетра метил родамина-N-гидрокси succinimide эфира

НОЧЬ на ночь

v/v объем/объем

w/v вес/объем

Page 8

1. Введение

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Введение