XI.Исследования прионов дрожжей и других микромицетов

У дрожжей обнаружен ряд прионных белков, из которых хорошо исследованы только два - Sup35 и Ure2. Остальные открыты сравнительно недавно и о них известно не много.

Детерминант [Psi+] кодируется геном Sup35, фактором терминации трансляции дрожжей. Он наследуется нехромосомно и фенотипически проявляется по усилению действия слабого серин-специфического нонсенс-супрессора SUQ5 (кодирует серин-специфическую тРНК с антикодоном, комлементарным нонсенс кодону UAA), который не супрессирует ade2-1 нонсенс мутацию в отсутствии детерминанта [Psi+]. Клетки, имеющие такой фенотип, растут на среде без аденина и имеют белый цвет колоний, когда клетки имеют фенотип [Psi-], они не могут расти на среде без аденина и имеют красный цвет колоний. Когда "семена" прионов - агрегаты белка Sup35 - попадают в клетку (обычно при скрещивании [Psi+] и [Psi-] штаммов дрожжей), клеточный Sup35 изменяет свою конформацию и присоединяется к фибриллам. Находясь в агрегированном состоянии, он не может осуществлять свою функцию терминации трансляции. Таким образом, стоп кодоны перестают быть сигналом терминации для рибосомы и происходит их сквозное прочтение и встраивание на их место серина (за счет имеющегося в клетке небольшого количества специфических аминоацил-тРНК с антикодоном комплементарным нонсенс кодонам), также возможен сдвиг рамки считывания. Следовательно, на рибосомах с большей вероятностью начинают синтезироваться более длинные белки. До сих пор не ясно, влияет ли это на выживаемость организма, но известно, что клетки, имеющие фенотип [Psi+], жизнеспособны.

У эукариот есть два фактора, отвечающих за функцию терминации трансляции: eRF1 (release factor 1) - фактор, узнающий все три нонсенс кодона и eRF3 - фактор, который стимулирует гидролиз пептидил-тРНК в присутствии ГТФ. Оба фактора взаимодействуют друг с другом, причем ГТФазная активность eRF3 зависит от его взаимодействия с рибосомой и eRF1. Гены дрожжей Sup45 и Sup35 кодируют факторы eRF1 и eRF3 соответственно. Как и их гомологи у млекопитающих, белки Sup35 и Sup45 взаимодействуют друг с другом, образуя комплексы, причем на Sup35 обнаружено два сайта связывания с Sup45. Делеционный анализ показал, что белок Sup35 состоит из трех функционально различных доменов: N-концевой домен необходим для возникновения прионной конформации и фенотипа [Psi+], но не важен для терминации трансляции; С-концевой домен эволюционно консервативен, необходим для жизнедеятельности клетки и осуществляет функцию терминации трансляции; домен М не имеет никакой незаменимой функции. Белок Sup35 связывается с Sup45 в двух участках, один из которых расположен в С домене, а второй в N и М доменах.

Доменная структура белка Sup35.Числами обозначены номера аминокислот.

Было показано, что агрегация белка Sup35 в клетках [Psi+] ингибирует его активность как фактора терминациии трансляции и приводит к нонсенс супрессорному фенотипу. Так как Sup45 связывается с Sup35, то при [Psi+] фенотипе этот белок тоже встраивается в агрегат и его функция тоже ингибируется. Это сразу должно дополнительно снизить эффективность терминации и увеличить неправильное прочтение нонсенс кодонов. Было показано, что сильная сверхэкспрессия Sup35 при фенотипе [Psi+] летальна, но если одновременно происходит сверхэкспрессия Sup45, то клетки выживают. Можно предположить, что увеличенное количество агрегированного белка Sup35 связывает большее количество Sup45. Это приводит к понижению уровня количества растворимого белка Sup45 и неэффективной терминации трансляции, недостаточной для жизнедеятельности клетки. Следовательно, можно сказать, что N домен белка Sup35 является цис-действующим репрессором функции своего С домена и транс-действующим репрессором функции белка Sup45. Известно, что шаперон дрожжей Hsp104 также включается в агрегаты Sup35. Возможно, что существуют другие белки, которые могут связываться с этими агрегатами и инактивироваться при фенотипе [Psi+].

Пока еще непонятно имеет ли детерминанта [Psi+] у дрожжей какое-нибудь биологическое значение. Так как при фенотипе [Psi+] увеличивается пропуск нонсенс кодонов и происходит трансляция (прочтение) стоп кодонов на некоторых мРНК, то могут возникать белки с удлиненным С-концом, обладающие модифицированной или совсем новой функцией. Хотя для дрожжей такие примеры пока неизвестны, не исключено, что такие белки существуют и что при определенных условиях [Psi+] клетки с увеличенным уровнем пропуска нонсенс кодонов могут иметь некоторые преимущества.

Детерминант [URE3] был обнаружен при исследовании генетики метаболизма азота у дрожжей. Эти исследования основывались на следующем наблюдении. Мутанты дрожжей S. сerevisiae, дефектные по активности аспартат-транскарбомоилазы, могут расти на среде с уреидосукцинатом только в отсутствии ионов аммония, так как аммоний подавляет перенос уреидосукцината из среды в клетку. Оказалось, что рост мутантов на этой среде может восстанавливаться за счет мутаций в гене Ure2 или за счет появления нехромосомно наследуемого детерминанта [URE3]. При этом фенотип мутантных клеток и клеток, несущих детерминант проявляется одинаково. Для [URE3] преимущества прионного состояния довольно очевидны, поскольку переход белка Ure2 в прионную форму позволяет дрожжам использовать некоторые плохо усваиваемые азотистые соединения. Неприонное состояние этого белка может оказаться предпочтительным в присутствии легко усваиваемых источников азота.

Детерминант с похожими прионными свойствами был обнаружен у мицелиального гриба Podospora anserina. Этот детерминант называется [Het-s] и регулирует образование гетерокарионов при скрещивании различных штаммов этого гриба. [Het-s] скорее всего тоже функционально важен. Этот детерминант является необходимым элементом системы вегетативной несовместимости, ограничивающей возможность скрещивания между дальнородственными штаммами этого гриба. Такого рода скрещивания потенциально полезны, так как увеличивают генетическое разнообразие популяции. Но это может быть и опасно в связи с возможностью распространения в популяции вирусов (у дрожжей и грибов они передаются только при слиянии клеток). Таким образом, в зависимости от обстоятельств, может быть выгодно и прионное и неприонное состояние.

Также существуют еще несколько прионов дрожжей. Это детерминанты [Pin], [Tau], и только что найденные прионные белки, Rnq1 и New1, для которых неизвестен фенотипический эффект. Детерминант [Pin] определяет, будет ли [Psi+] образовываться самопроизвольно при его сверхэкспрессии. Детерминант [Tau] тоже может модулировать функцию терминации трансляции, влияя на детерминант [Psi+].

Все эти цитоплазматически наследуемые детерминанты имеют основные прионные свойства, как-то устойчивость к некоторым денатурирующим агентам, плохая растворимость (склонность к агрегации), способность к конверсии клеточной формы своего белка в прионную изоформу. Также дрожжевые прионы могут быть элиминированы малыми концентрациями гуанидин-хлорида (GuHCl), белок-денатурирующего агента, не имеющего мутагенного эффекта. Штаммы с клеточной (неприонной) формой белка могут с низкой частотой приобретать прионное состояние, причем частота реверсий сильно увеличивается в присутствии плазмид, сверхэкспрессирующих белок (например, для URE2 это увеличение составляет 2 порядка). Такое быстрое изменение прионного фенотипа по сравнению с генным, позволяет популяции меняться, чтобы подстраиваться под изменчивые условия окружающей среды.

Известно что поли-глутамин-аспарагин-богатые (Q/N-богатые) последовательности обладают склонностью формировать амилоидные фибриллы. В последовательностях прионных белков дрожжей в больших количествах присутствуют повторы глутамина и аспарагина. Однако прионный белок млекопитающих и гриба P. anserina не содержит Q/N-богатых районов.

Q/N-богатые домены эукариот, по-видимому, обладают консервативной функцией, заключающейся в способности осуществлять специфические белок-белковые взаимодействия. Скрининг на эти домены позволяет выявлять белки, которые потенциально могут иметь прионные или/и амилоидо-образующие свойства. Такие белки уже были выявлены у дрожжей (белки Rnq1 и New1) и для них было показано существование прионных свойств. Однако в обычных условиях белки с Q/N-богатой последовательностью могут и не проявлять своих прионных свойств, таким образом, являясь "скрытыми прионами". Их можно попытаться выявить, изменяя концентрации факторов, влияющих на образование прионных агрегатов.

[1. Александров. И. М. Шапероны и прионы: регуляция конформационных сотояний прионного белка дрожжей SUP35 [Электронный ресурс] / Александров И. М. – режим доступа: http://nature.web.ru/db/msg.html?mid=1163831&uri=1.html]

XII. Заключение

Изучение прионов и вызываемых ими заболеваний является новой, быстро развивающейся областью биомедицинских исследований. Проблема этих болезней,оставаясь до последнего времени экзотической в связи с их большой редкостью в человеческой популяции, в последние годы приобрела важное научно-практическое значение.

Практический интерес связан прежде всего с разразившейся эпизоотией губкообразной энцефалопатии коров в Великобритании, а также с выявлением, в основном в Великобритании, молодых людей с болезнью Крейтцфельдта-Якоба (новый вариант БКЯ) и доказательством возможности передачи этого заболевания людям в результате употребления в пищу мясопродуктов,полученных из зараженных животных. И хотя для населения России нет прямой угрозы заражения инфекционным прионным белком, на современном этапе важным является налаживание в общегосударственном масштабе работы по регистрации прионных болезней человека и животных на всей территории страны с обращением особого внимания на группы риска (работники скотоводческих и звероферм, боен, мясокомбинатов и др.).

Постоянно увеличивающийся теоретический интерес к проблеме обусловлен результатами молекулярно-биологических исследований прионов, позволивших собрать и уже в большой мере систематизировать значительный фактический материал о структуре, функции и накоплении в зараженном организме этих новых и необычных возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных.

В заключение следует подчеркнуть, что все возрастающий мировой интерес к прионам и прионным болезням обусловлен в первую очередь тем, что прионы представляют собой совершенно новый класс инфекционных агентов, открытиекоторых без преувеличения можно сравнить по своему значению с открытием А.Левенгуком мира микроорганизмов или с открытием Д.И.Ивановским царства вирусов

[ 5. Сбойчаков. В.Б. Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований [Электронный ресурс] / режим доступа:

http://fictionbook.ru/author/viktor_sboyichakov/mikrobiologiya_s_osnovami_yepidemiologii/read_online.html?page=4]

XIII. Литература

1. Александров. И. М. Шапероны и прионы: регуляция конформационных сотояний прионного белка дрожжей SUP35 [Электронный ресурс] / Александров И. М. – режим доступа: http://nature.web.ru/db/msg.html?mid=1163831&uri=1.html

2. Википедия. Прионы [Электронный ресурс] / Режим доступа: http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9F%D1%80%D0%B8%D0%BE%D0%BD

3. Григорьев В. Б. — Прионные болезни человека и животных. — Вопросы вирусологии, т.49(№ 5), с.4-12, 2004 (обзор)

4. Покровский В. И., Киселев О. И., Черкасский Б. Л. — Прионы и прионные болезни — РАМН, 2004, 384 стр.

5. Сбойчаков. В.Б. Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований [Электронный ресурс] /режим_доступа: http://fictionbook.ru/author/viktor_sboyichakov/mikrobiologiya_s_osnovami_yepidemiologii/read_online.html?page=4

6. Шкундина, И. С. М. Д. Тер-Аванесян. Прионы. Успехи биологической химии, т. 46, 2006 (обзор)

7. Шувалова. Е.П. Прионные болезни [Электронный ресурс] / режим доступа: https://med.wikireading.ru/1007