Фракционирование сыворотки крови спиртовым методом

(вариант Б)

Осаждение гамма-глобулина спиртовым методом происходит, в основном, в 3 этапа:

I этап - осаждение гамма- и бета-глобулинов;

II этап - отделение бета-глобулина;

III этап - осаждение из надосадочной жидкости гамма-глобулина.

Приготовление растворов. Для осаждения белков сыворотки использую растворы 53 % и 26 %-ного спирта, 2-молярного ацетата натрия, 2-молярной уксусной кислоты, ацетатных буферов и одномолярного бикарбоната натрия.

1). Раствор 53 %-ного спирта готовится смешиванием 1150 мл 96 %-ного спирта с 1000 мл дистиллированной воды (концентрацию спирта проверяют спиртометром).

2). Раствор 26 %-ного спирта готовят смешиванием 360 мл 96 %-ного спирта с 1000 мл дистиллированной воды, или 53 %-ный спирт разбавляется водой в 2 раза (концентрацию спирта проверяют спиртометром).

3). Раствор 2-молярного ацетата натрия готовят следующим образом: растворяют 272,2 г кристаллического уксуснокислого натрия в дистиллированной воде и объём доводят до 1 л (молекулярный вес СНзСООН ∙ ЗН₂О равен 136,1).

4). Раствор 2-молярной уксусной кислоты готовят из концентрированной или ледяной уксусной кислоты, крепость ее измеряют ареометром. Для приготовления 2-молярной уксусной кислоты необходимо взять 120,1 г кислоты на 1 л дистиллированной воды (молекулярный вес уксусной кислоты - 60,05). По удельному весу уксусной кислоты определяют, какое количество мл её необходимо взять для приготовления 1 л раствора.

Таким образом, если у нас имеется 100 %-ная уксусная кислота с удельным весом 1,050, то нужно взять её 114,4 мл, что будет соответствовать 120,1 г, и растворить дистиллированной водой до 1 л.

5). Ацетатный буфер № 1 (рН = 4,65) готовят смешиванием 2-молярной уксусной кислоты с 2-молярным раствором уксуснокислого натрия, в отношении 1:1. Через несколько часов проверяют рН буфера потенциометром.

6). Ацетатный буфер № 2 (рН = 3,97-4,0) готовят смешиванием 2-молярной уксусной кислоты с 2-молярным ацетатом натрия в отношении 4,5:1.

7). Раствор одномолярного бикарбоната натрия готовят, растворяя 84,0 г NaHCО₃ в дистиллированной воде при лёгком подогреве (до t = 40-50⁰ С) на водяной бане, затем объём раствора доводят дистиллированной водой до 1 л.

Осаждение белков.

Первое осаждение. В сыворотке измеряют рН, которая должна быть равной 7,0-7,3. Если рН сыворотки выше 7,3, к неё добавляют тонкой струйкой 2-молярный ацетатный буфер № 1 в количестве 40-60 мл на 10 л сыворотки. После установления рН сыворотку охлаждают до 0⁰ С, одновременно охлаждают предназначенный для осаждения 53 %-ный спирт до t = –15⁰ С. Охлаждённый 53 % спирт добавляют в охлаждённую сыворотку тонкой струйкой при непрерывном перемешивании в количестве 0,883 л 53 %-ного спирта на 1 л сыворотки. Температура сыворотки постепенно снижается до минус 5⁰ С, а концентрация спирта в сыворотке достигает 26 %. Температура камеры должна быть при этом ниже минус 5⁰ С.

При первом осаждении в осадок выпадают глобулины, надосадочная жидкость содержит, в основном, альбумины. Осадок глобулинов отделяется центрифугированием на холоде в той же камере.

Второе осаждение. Осадок глобулинов взвешивают на холоде. В среднем из 1 л сыворотки получается 65-75 г влажного осадка. Осадок глобулинов размешивают с охлаждённым (до льдинок) физиологическим раствором (1 л раствора на 1 кг осадка) до гомогенной взвеси.

Размешивание проводят в смесителях, установленных в холодной камере, после чего к взвеси добавляется физиологический раствор в полуторном объёме к полученному гомогенату.

Второе осаждение ведут при рН = 5,0-5,1, что достигается добавлением к раствору осадка ацетатного буфера № 2. После доведения рН, к полученному раствору глобулинов тонкой струйкой добавляют охлаждённый до t = –10⁰ С 26 %-ный спирт, из расчёта 1 л спирта на 1 л общего объёма полученного раствора глобулинов (включая осадок, физиологический раствор и ацетатный буфер). При этом температура раствора медленно снижается до минус 3-4⁰ С.

В случае отмеривания необходимого количества спирта при комнатной температуре, учитывается сжатие объёма спирта приохлаждении и добавляется дополнительно 14 мл 26 %-ного спирта к каждому рассчитанному литру. Конечная концентрация спирта в растворе достигает 13 %.

Смесь глобулинов со спиртом оставляют на ночь при минусовой температуре для формирования осадка. При втором осаждении в осадок уходит бета-глобулиновая фракция сыворотки, которая затем отделяется центрифугированием. В центрифугате остаётся гамма-глобулиновая фракция.

Третье осаждение. Центрифугат подщелачивают 2-молярным раствором бикарбоната натрия до рН = 6,9-7,2, для чего требуется 12-15 мл бикарбоната на 1 л раствора. Ионную силу раствора доводят до 0,05 добавлением сухой соли хлористого натрия.

Осаждение гамма-глобулина ведут при постоянном помешивании центрифугата 96 %-ным спиртом, охлаждённым до t = –15 - –17⁰ С из расчёта 157 мл спирта (плюс 20 мл на сжатие) на 1 л всего объёма.

Температуру раствора постепенно снижают с –3 до – 4- –6⁰ С. Конечная концентрация спирта в растворе при этом равняется 26 %.

Смесь оставляют при этой же температуре на ночь. На следующий день надосадочную жидкость декантируют, нижний слой с осадком центрифугируют на холоде с охлаждением частей центрифуги.

Осадок гамма-глобулина при получении его в сухом виде растворяют в полуторном объёме физиологического раствора по отношению к весу осадку, разливают по кюветам и высушивают из замороженного состояния под вакуумом.

При получении гамма-глобулина в жидком виде, осадок снимают на стерильное фильтровальное полотно (бельтинг), которое перед этим охлаждается в камере, завёртывают его, помещают на лоток из нержавеющей стали и прессуют в камере при t = –5 - –6⁰ С 18-20 часов для снижения влажности. Давление пресса должно быть не выше 20 кг на 1000 см².

Прессованный осадок взвешивают, растворяют в физиологическом растворе до 10 %-ной концентрации белка, которую контролируют рефрактометром. Затем проводят стерилизующую фильтрацию и расфасовку.

При плохом выходе или загрязнении гамма-глобулина другими белковыми фракциями, процессе фракционирования проводят дополнительное осаждение и переосаждение. В частности, проводят повторное первое осаждение и переосаждение гамма-глобулина, начиная со второй стадии процесса фракционирования.

Следует отметить, что более полный выход гамма-глобулина получается только при проведении повторного переосаждения бета-глобулиновой фракции.