И последующей инкубации в аутологичной плазме крови

 

Ивонин А.Г.^1,2, Пименов Е.В.^1,2, Оборин В.А.³, Чернядьев А.В.³

¹Отдел сравнительной кардиологии Коми НЦ УрО РАН, г. Сыктывкар, Республика Коми, Россия

²ФГБОУ ВО Вятская ГСХА, г. Киров, Россия

³ФГБОУ ВО ВятГУ, г. Киров, Россия

 

При традиционных способах введения антибиотиков наблюдаются такие побочные явления, как токсические и аллергические реакции, угнетение иммунитета, снижение общей реактивности организма [6]. Одним из способов решения данной проблемы является создание новой лекарственной формы антибиотиков путем заключения препаратов в аутологичные эритроциты. Использование эритроцитов в качестве переносчиков антибиотиков позволит снизить пиковую концентрацию препаратов в плазме крови в момент введения, увеличить время циркуляции лекарственных средств в кровотоке (за счет медленного высвобождения из клеточных «контейнеров»), минимизировать нежелательные реакции организма на медикаментозное воздействие [2, 10]. Сегодня имеются успешные примеры применения эритроцитарных носителей антибиотиков в медицине [8], однако в ветеринарной практике данное направление исследований остается без должного внимания.

Ранее нами была предложена методика экстракорпорального («вне тела») насыщения эритроцитов мелких домашних животных антибиотиками класса цефалоспоринов [7].

Цель работы – оценка морфологических свойств эритроцитов собаки при включении цефалоспоринового препарата, а также в условиях, моделирующих пребывание клеток, «нагруженных» антибиотиком, в кровеносном русле.

Материалы и методы.

Объектом исследования являлись эритроциты стабилизированной гепарином (5,0 ЕД/мл) венозной крови клинически здоровых собак (n=10) массой 12-18 кг. Эритроциты отделяли от плазмы и других форменных элементов крови центрифугированием (1000 g, 10 мин, 4°С) и дважды отмывали фосфатно-солевым буфером (рН 7,4).

Для включения в клетки использовали цефалоспориновый антибиотик III поколения цефтриаксон (ЦТР) («Биосинтез», Россия). Насыщение эритроцитов ЦТР осуществляли путем совместной инкубации клеток с препаратом в буферном растворе при 37°С [7]. Длительность инкубации составляла 20 мин, гематокрит суспензии – 80%, концентрация антибиотика – 20 мг/мл. В качестве «корректора» связывания ЦТР с эритроцитами применяли апротонный растворитель диметилсульфоксид (ДМСО) в концентрации 1,0 мг/мл среды [8]. Количество цефалоспорина в клетках после инкубации проб определяли микробиологическим методом [1].

Для моделирования поведения «нагруженных» антибиотиком эритроцитов в кровотоке клетки отделяли от несвязанного препарата путем центрифугирования и инкубировали в аутологичной плазме крови (гематокрит 40%) при 37°С в течение 30 минут.

Морфологию и поверхностную архитектонику эритроцитов изучали при помощи световой и сканирующей электронной микроскопии. Для этого клетки фиксировали в 2,5% забуференном растворе глутаральдегида в течение 1 часа при комнатной температуре, дважды промывали буфером и дважды – дистиллированной водой (1000 g, 5 мин, 4°С). При использовании метода световой микроскопии каплю взвеси фиксированных эритроцитов переносили на предметное стекло, накрывали покровным и исследовали под микроскопом «Миктрон-400М» («Ломо», Россия). Для проведения сканирующей электронной микроскопии взвесь клеток наносили тонким слоем на покровное стекло, высушивали на воздухе и напыляли слоем платины толщиной 6-7 нм. Препараты просматривали с использованием микроскопа JSM-6510 LV («Jeol», Япония) при ускоряющем напряжении 15 кВ.

Количественное распределение морфологических форм эритроцитов в препаратах оценивали по методике [3]. Цифровые значения представлены в виде среднего значения ± среднеквадратичное отклонение. Статистическую значимость различий между сравниваемыми группами определяли по непараметрическому критерию Манна-Уитни для независимых выборок, для зависимых выборок – по критерию Вилкоксона.

Результаты и обсуждение.

В предварительных экспериментах установлена зависимость эффективности насыщения эритроцитов ЦТР от наличия в инкубационной среде ДМСО. При отсутствии апротонного растворителя в клетки включалось 40,9±5,2% антибиотика. Внесение в пробы ДМСО приводило к повышению (Р<0,01) уровня включения ЦТР в эритроциты до 65,5±5,4%. Ввиду наличия у молекул цефалоспоринов ионогенных групп [9] вероятным механизмом связывания ЦТР с эритроцитами является фиксация на клеточной мембране. Также не исключено проникновение диссоциирующих на ионы молекул ЦТР внутрь клеток через белковые каналы мембраны. Повышение степени насыщения эритроцитов антибиотиком в присутствии ДМСО связывали с описанной в литературе [12] способностью последнего погружаться в липидную фазу биологических мембран, изменяя ее стабильность и проницаемость для других соединений.

Микроскопические исследования показали, что насыщение эритроцитов ЦТР сопровождалось выраженными изменениями морфологии и поверхностной архитектоники клеток (таблица 1). При обработке эритроцитов ЦТР по сравнению с контролем (клетками, инкубируемыми в аналогичных условиях в фосфатном буфере) значительно сокращалась доля дискоцитов (Р<0,01), снижалось количество плоских клеток, сфероцитов и стоматоцитов (чашеобразных клеток) (Р<0,05), но увеличивалось содержание эхиноцитов I порядка (дисков с одним или несколькими выростами), II порядка (дисков с грубыми конусовидными выростами по всей поверхности) и III порядка (сферических клеток с тонкими отростками в виде шипов) (Р<0,01). При инкубации эритроцитов с ЦТР в присутствии ДМСО по сравнению с обработкой одним антибиотиком в пробах снижалось содержание эхиноцитов I и II порядков (Р<0,01), но увеличивалось количество эхиноцитов III порядка (Р<0,01). Электронные микрофотографии морфологических форм эритроцитов в контроле и после обработки ЦТР приведены на рисунке 1а и б. Часть материалов по оценке поверхностной архитектоники клеток при насыщении антибиотиком опубликована ранее [5].

Изменения морфологических параметров эритроцитов после обработки ЦТР могли быть обусловлены характером взаимодействия антибиотика с мембранными структурами. Согласно гипотезе [11] к появлению кренированных (с наружными выростами) эритроцитов приводит встраивание экзогенных соединений во внешний монослой клеточной мембраны. Таким образом, наблюдаемая эхиноцитарная трансформация эритроцитов, возможно, объяснялась накоплением молекул ЦТР преимущественно в наружном слое мембраны и его непропорциональным расширением. Форма эритроцитов при обработке ЦТР без ДМСО, по-видимому, была также связана с высоким значением осмолярности среды, содержащей слабо проникающий в клетки антибиотик. Увеличение содержания эхиноцитов III порядка в пробах с ЦТР и ДМСО могло быть вызвано повышением проницаемости клеточной мембраны для антибиотика, индуцированного молекулами ДМСО. В этом случае поступление ЦТР внутрь эритроцитов приводило к увеличению объема внутриклеточной жидкости и вызывало разбухание клеток (образование эхиноцитов III порядка).

 

Таблица 1 - Морфологический состав эритроцитов собаки при различных вариантах экстракорпоральной обработки ЦТР и последующей инкубации в аутоплазме, %

Формы эритроцитов	Вариант эксперимента
контроль (инкубация в буфере)	обработка ЦТР	обработка ЦТР и ДМСО	обработка ЦТР + инкубация в аутоплазме	обработка ЦРТ и ДМСО + инкубация в аутоплазме
Дискоциты (нормоциты)	81,9±3,2	0,4±0,2**	0,3±0,1**	38,2±8,4**##	34,8±9,7**##
Плоские	6,3±1,0	4,3±1,2*	3,8±0,8**	9,8±1,6*##	8,7±1,4*##
Эхиноциты: I порядка II порядка III порядка	4,6±0,9 3,7±1,1 0,9±0,5	14,6±2,4** 74,4±4,9** 5,2±1,9**	7,9±1,8**°° 40,8±7,2**°° 46,1±6,6**°°	25,8±4,2**## 23,9±7,0**## 1,2±0,3##	23,5±7,4**## 27,4±4,1**## 4,3±2,5**##
Сфероциты	1,4±0,4	0,7±0,3*	0,9±0,4*	0,6±0,2*	0,7±0,4*
Стоматоциты	1,2±0,8	0,4±0,2*	0,2±0,1**	0,5±0,3*	0,6±0,3*

Примечание: *Р<0,05, **Р<0,01 – различия статистически значимы по сравнению с контролем; °°Р<0,01 – по сравнению с обработкой ЦТР без ДМСО; ^##Р<0,01 – по сравнению с «нагруженными» ЦТР клетками до инкубации в аутоплазме.

 

 

а

в

г

б

 

 

 

Рисунок 1 - Электронные микрофотографии эритроцитов собаки: а – контроль; б – после обработки ЦТР; в – после обработки ЦТР с ДМСО; г – после обработки ЦТР с ДМСО и инкубации в аутологичной плазме. Увеличение ×2000-2500.

 

Инкубирование «нагруженных» ЦТР клеток в аутологичной плазме крови значительным образом сказывалось на морфологии клеток (табл. 1, рис. 1г). После обработки плазмой в пробах увеличивалось содержание дискоцитов, плоских клеток и эхиноцитов I порядка (Р<0,01), снижалось количество эхиноцитов II и III порядков (Р<0,01). Полученные результаты согласовывались с данными об обратимом характере превращения «дискоцит-эхиноцит» [4]. Повышение числа нормоцитов и снижение степени эхиноцитарной трансформации клеток в экспериментах связывали как с помещением эритроцитов в физиологическую среду, так и выходом из них части ЦТР (параллельно нами показано, что инкубация в плазме приводит к выделению из эритроцитов во внеклеточную среду порядка 30-36% связанного ранее антибиотика). Можно предположить, что при реинфузии модифицированных ЦТР эритроцитов в кровеносное русло также будет происходить их обратная трансформация в нормальную дискоидную форму, необходимую для прохождения через узкие капилляры. Это, в свою очередь, может свидетельствовать об отсутствии выраженного отрицательного влияния эритроцитов-носителей на процессы тканевой микроциркуляции.

Выводы

Обработка эритроцитов собаки цефалоспориновым антибиотиком в условиях in vitro приводит к структурным изменениям мембраны, выражающимся в трансформации клеток по эхиноцитарному пути. Внесение в среду инкубации ДМСО с целью стимуляции накопления антибиотика в клетках усиливает морфологические изменения эритроцитов. Инкубация «нагруженных» цефалоспорином клеток в аутологичной плазме крови способствует приобретению ими исходной морфологической формы (дискоцитов). Полученные результаты расширяют представления о характере взаимодействия цефалоспоринов с эритроцитарной мембраной в условиях экстракорпоральной обработки клеток, позволяют прогнозировать поведение эритроцитов-переносчиков в кровотоке.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта РФФИ 15-04-06312.

 

Литература

1. Антибиотики, сульфаниламиды и нитрофураны в ветеринарии. Справочник / В.Ф. Ковалев, И.Б. Волков, Б.В. Виолин и др. – М.: Агропромиздат, 1988. – 223 с.

2. Генинг, Т.П.Использование форменных элементов крови для направленной доставки химиотерапевтических и диагностических препаратов в очаг поражения / Т.П. Генинг, И.И. Колкер, Ж.Ш. Жумадилов// Антибиотики и химиотерапия. – 1988. Т. 33, № 11. – С. 867–871.

3. Козинец, Г.И. Поверхностная архитектоника клеток периферической крови в норме и при заболеваниях системы крови / Г.И. Козинец, Ю.А. Симоварт. – Таллин: Валгус, 1984. – 116 с.

4. Кузник, Б.И. Клеточные и молекулярные механизмы регуляции системы гемостаза в норме и при патологии: Монография / Б.И. Кузник. - Чита: Экспресс-издательство, 2010. - 832 с.

5. Морфофункциональные характеристики эритроцитов собаки при экстракорпоральном насыщении цефалоспориновыми антибиотиками / А.Г. Ивонин, Е.В. Пименов, В.А. Оборин, А.В. Чернядьев // Известия Коми НЦ УрО РАН. – 2016. - №4 (28). - С.24–30.

6. Никитин, А.В. Антибиотики и макроорганизм / А.В. Никитин // Антибиотики и химиотерапия. – 1999. – Т. 44, № 12. – С. 31–36.

7. Оценка возможности включения цефалоспориновых антибиотиков в эритроциты мелких домашних животных / А.Г. Ивонин, Е.В. Пименов, С.Н. Копылов, В.А. Оборин // Вестник ветеринарии. – 2015. – № 73 (2). – С. 64-68.

8. Фармакоэкономический анализ применения клеточно-ассоциированной антибактериальной терапии при внебольничной пневмонии различной степени тяжести / Н.А. Пятаев, В.В. Кузин, Г.А. Бояринов и др. // Вестник интенсивной терапии. – 2006. – № 5. – С. 14-17.

9. Чуев, П.Н. Клиническая фармакология цефалоспоринов / П.Н. Чуев, В.И. Кресюн, О.Ю. Каташинский. – Одесса: Черноморье, 1997. – 136 с.

10. Effective drug targeting by erythrocytes as carrier systems / V.S. Gopal, A.N. Ranjith Kumar, N.A. Usha et al. // Curr. Trends Biotechnol. Pharm. – 2007. –Vol. 1, №1. – Р. 18-33.

11. Sheets, M.P. Biological membranes as bilayer couples. A molecular mechanism of drug-erythrocyte interactions / M.P. Sheets, S.J. Singer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1974. – Vol. 71, № 11. – P. 4457-4461.

12. Yu, Z.W. The modulation of membrane structure and stability by dimethyl sulphoxide (review) / Z.W. Yu, P.J. Quinn // Mol. Membr. Biol. – 1998. – Vol. 15, № 2. – Р. 59-68.

 

УДК 616.619