Распределительная хроматография.

Распределительная хроматография основана на различии в распределении компонентов пробы между двумя компонентами систе­мы, содержащей не смешиваемые жидкие фазы - подвижную фазу и неподвижную, которая нанесена на твердый носитель. Компоненты биопробы, растворенной в такой системе, распределяются между жид­кими фазами в зависимости от степени их растворимости в этих фазах или, точнее, в соответствии с их сродством к этим фазам. В зависимо­сти от состояния подвижной фазы процесс носит название либо жидко-жидкостной, либо газо-жидкостной распределительной хроматографии.

При проведении газо-жидкостной распределительной хроматографии на границе подвижной и неподвижной фаз пузырьки газа проходят через жидкость, в которой растворены компоненты пробы, тогда на поверхности раздела концентрируются компоненты с боль­шой поверхностной активностью и после оседания их можно выделить (редко используется на практике).

Чтобы жидкие фазы не смешивались, они должны сильно отли­чаться по степени полярности. Обычно полярный растворитель (спирт или вода) наносится на пористый носитель (силикагель, оксид алюми­ния, силикат магния). Важным преимуществом жидко-жидкостной распределительной хроматографии по сравне­нию с твёрдожидкостной адсорбционной хроматографии является то, что жидкую подвижную фазу легче менять без пере­набивки колонки. Но с другой стороны легкость удаления неподвижной фазы приво­дит к возможности ее вымывания.

В распределительной хроматографии большое значение имеет прочность удерживания жидкой неподвижной фазы на нерастворимом, инертном твердом носителе. Неподвижная фаза закрепляется на носителе за счет адсорбции и проникновения в поры. Прочность удерживания определяется также силами адгезии и химическими свя­зями.

Распределительная хроматография может использоваться при ана­лизе всех классов веществ, в особенности, для разделения довольно сложных смесей. Чаще всего жидко-жидкостной распределительной хроматографии используется для разделения низкомолекулярных соединений - аминокислот, гормонов, витами­нов, синтетических лекарств и др.

Ионообменная хроматография.

В отличие от адсорбционной, в основе ионообменной хроматогра­фии лежат электростатические взаимодействия. Она осно­вана на различной способности разделяемых ионов к ионному обмену с ионитом — специальным веществом, которое вводится в неподвижной фазе, пре­вращая ее тем самым в ионообменник.

Ионит представляет собой нерастворимую полимерную основу (матрицу), несущую химически связанные ионогенные группы (группы ионов, способных взаимодействовать за счет электростатических сил с ионами противоположного знака). Противоположно заряженные ионы удерживаются на матрице за счет сил электростатического взаимодей­ствия и могут обмениваться на другие ионы (компоненты пробы), при­сутствующие в подвижной фазе.

Многие вещества биологического происхождения содержат так на­зываемые ионогенные группы, которые являются остатками сильных или слабых кислот и оснований. Вещества, участвующие в ионообменной хроматогра­фии, всегда являются либо цвиттер-ионами (в целом нейтральные молеку­лы, несущие равное число положительных и отрицательных зарядов), либо амфолитами (крупные молекулы, на поверхности которых распо­лагается несколько ионогенных групп, способных заряжаться). Амино­кислоты, пептиды и белки — типичные амфолиты, при этом в зависи­мости от рН среды и ее химического состава они могут быть либо за­ряжены, либо быть нейтральными.

Таким образом, в ионообменной хроматогра­фии для разделения веществ используются различия в их электрических свойствах. В качестве примера ионооб­менного процесса можно привести операцию смягчения воды, при ко­торой ионы кальция и магния обмениваются на ионы натрия. Помимо обычного обмена ионов на ионитах можно проводить разделение заря­женных частиц, прежде всего биополимеров (белки, нуклеиновые ки­слоты), некоторые из которых обладают амфотерными свойствами.

В качестве подвижной фазы для ионообменной хроматогра­фии выступает вода, а в качестве сорбентов используются твердые или гелевые матрицы, к которым ковалентно пришиты ионогенные группы. Сорбент в целом электронейтрален, од­нако в водной среде часть ионов диссоциирует, и в любой момент ка­кое-то количество фиксированных зарядов оказывается свободным. Если в подвижной фазе имеются вещества в ионизированной форме и их заряд противоположен, то они за счет электростатических взаимодействий удерживаются на свободных фиксированных зарядах ионообменника, и в результате при движении элюента по колонке происходит разделе­ние компонентов биопробы за счет ионного обмена.

По своему химическому строению матрицы ионообменника под­разделяются на несколько групп:

· синтетические смолы на основе полистирола или полиакриламида;

· сефадексы на основе сшитого декстрана;

· сефарозы (на основе агарозы);

· целлюлозные ионообменники на основе микрокристаллической или сшитой микросферической целлюлозы;

· неорганические иониты на основе поверхностно-модифицированных силикагелей.

В отличие от других видов хроматографии, при ионообменной хроматогра­фии всегда ис­пользуют элюент переменного состава. При этом ионную силу раство­ра изменяют при помощи градиентного смесителя следующим обра­зом. В начале процесса на колонку из смесителя подают элюент с низ­кой ионной силой. По мере изменения объема раствора в смеситель из отдельного резервуара начинает поступать буфер с высокой ионной силой, при этом содержимое смесителя непрерывно перемешивается при помощи магнитной мешалки. В результате ионная сила элюента, подаваемого на колонку, постепенно возрастает, и формируется линей­ный градиент концентрации буферного раствора. Процесс разделения завершается при концентрации буфера, находящегося в резервуаре.

Рассмотрим основные стадии технологической процедуры анализа при проведении ионообменной хроматогра­фии.

1. Подготовка биопробы. Содержание солей в биопробе должно быть минимальным, поэтому при необходимости проводится ее обессоливание с помощью гель-хроматографии или диализа, либо ее раз­бавление.

2. Подготовка ионита. Необходимое количество ионита рассчитывают по его емкости, но не более 10 % объема сорбента, так как в ос­тальном объеме осуществляется собственно процесс разделения. Перед каждым циклом разделения ионит обязательно подвергается полной регенерации (переводится в активную форму).

3. Заполнение колонки производится так же, как в адсорбционной хроматографии.

4. Внесение биопробы. Небольшие объемы вносят при помощи шприца. Если объем биопробы составляет несколько литров, то рас­твор подается на колонку с помощью насоса.

5. Разделение. Проводят градиентное элюирование, причем формируют подвижную фазу с градиентом ионной силы (с помощью градиентного сме­сителя). При этом суммарный объем элюента должен быть равен при­ мерно пяти объемам колонки.

Известно несколько областей применения ионообменной хроматогра­фии в зависимости от вида ионитов.

1. При помощи синтетических ионитов решаются следующие пре­паративные задачи:

· деионизация воды (деминерализованную воду часто ошибочно называют дистиллированной);

· удаление ионогенных примесей, присутствующих в органиче­ских растворителях;

· очистка биополимеров, например, отделение детергентов и амфолитов, присутствующих в растворах белковых препаратов;

· получение препаратов радиоактивных изотопов;

· ускорение процессов за счет использования в качестве катализаторов многих технологических процессов — омыления, дегидратации, гидратации, полимеризации, перегруппировки, образования ацетатов, нитрования, эпоксидирования и др.

Возможно решение ряда важных аналитических задач, таких как:

· определение общего содержания солей в растворе (путем ионообмена и последующего определения концентрации ионов водорода);

· удаление посторонних ионов при неорганическом анализе (на­пример, железа, алюминия, никеля, фтора и др.);

· анализ гидролизатов белков, олигонуклеотидов, полисахаридов;

· определение уровня загрязнения окружающей среды;

2. При помощи ионитов на основе сефадекса и целлюлозы решают­ся следующие задачи:

· препаративное выделение белков, пептидов, олигонуклеотидов;

· выделение полисахаридов и липидов, несущих заряженные группы;

· иммобилизации ферментов.

3. Иониты на основе агарозы применяются в тех же целях, что и сефадексы; кроме того, на них можно фракционировать вещества с молекулярной массой до 10^-6 г/моль.

4. Модифицированные силикагели используются в режиме высокого давления для разделения всех классов заряженных веществ в аналити­ческом и препаративном масштабе.

Гель-хроматография.

Гель-хроматография (молекулярно-ситовая хроматография) — метод, основанный на различной способности молекул раз­ного размера проникать в поры нейтрального геля, который служит неподвижной фазой.

Схематично принцип работы молекулярных сит представлен на рис.3, где последовательно показаны стадии прохождения молекул разного размера через колонку. В качестве неподвижной фазы используется гель, имеющий поры определенного диаметра, поэтому более крупные мо­лекулы не диффундируют в поры гранул и элюируются (вымываются) быстрее, в то время как молекулы небольшого размера удерживаются в порах и элюируются позже.

Хроматографические свойства геля определяются природой матри­цы и, прежде всего, пористостью ее структуры. В зависимости от спо­собности набухать в воде или в органических растворителях материа­лы для гель-хроматографии подразделяются на гидрофильные и органофильные (гидрофобные). К ним предъявляются определенные требования: они должны быть пористыми со средними размерами пор, не должны обладать сорбционной способностью и иметь высокую механическую прочность.

Рис.3. Принцип работы молекулярных сит

Самыми распространенными носителями являются сефадексы с различными размерами пор, а также полиакриламида, агарозные гели, сефакрил, гидрогель и некоторые другие. Для гель-хроматографии при высоком давлении применяют носители на основе пористого силикагеля и по­ристого стекла. Эффективность разделения слабо зависит от типа элюента.

Отметим основные стадии технологической процедуры анализа при гель-хроматографии.

1. Заполнение колонок.

2. Нанесение биопробы при помощи шприца.

3. Элюирование. Скорость подачи элюэнта регулируют посредст­
вом изменения перепада гидростатического давления или задают при
помощи насоса.

Область применения гель-хроматографии достаточно широка и включает:

· фракционирование и выделение в водной среде и органических растворителях белков, липидов, стероидов, нуклеиновых кислот и по­лимеров;

· разделение различных веществ в препаративном масштабе (на­пример, биотехнологическое производство);

· определение мольных масс биополимеров, в том числе в соста­ве сложных смесей;

· определение степени полимеризации синтетических полимеров;

· фракционирование субклеточных частиц, вирусов;

· отделение радиоактивных низкомолекулярных веществ при вве­дении изотопной метки в биополимеры.

Тонкослойная хроматография.

В зависимости от аппаратурного оформления процесса разделения различают хроматографию в колонках различных типов и в тонком слое сорбента (тонкослойная хроматография). Данный вариант приобрел большое распространение в медико-биологических лаборато­риях благодаря ряду преимуществ. В частности, это объясняется тем, что хроматографию на пластинках проводят в очень мягких условиях, что позволяет анализировать нестойкие вещества, которые не могут переносить продолжительные по времени операции преобразований.

Тонкослойная хроматография основана на различии скоростей перемещения компонентов анализируемой пробы в плоском тонком слое сорбента при движении по нему растворителя (элюента) под действием капиллярных или гра­витационных сил. Разделение в этом методе осуществляется посредст­вом многократного пересечения молекулами вещества границы фаз, т. е. вследствие многократного повторения акта распределения вещест­ва между подвижной и неподвижной фазами. Неподвижной фазой служит либо сухой сорбент (адсорбционная хроматография), либо сорбент, покрытый жидкой фа­зой, например, слоем воды (распределительная хроматография). Рас­творители подбирают в соответствии со свойствами разделяемых ве­ществ.

Можно выделить несколько вариантов тонкослойная хроматография в зависимости от принципа движения элюента:

1. движение элюента под действием капиллярных сил (бумажная,
тонкослойная и высокоэффективная тонкослойная хроматография);

2. движение элюента под действием внешних сил:

· давления;

· центробежной силы (ротационная хроматография);

· высокого давления (круговая тонкослойная хроматография под высоким давлением).

Принцип проведения тонкослойная хроматография показан на рис.4. Исследуемая биопроба вносится на стартовую линию «а-а». По мере продвижения вдоль слоя сорбента проба разделяется на компоненты, образующие на его поверхности характерные пятна (зоны). В различных системах рас­творители (подвижной фазы) обладают разной подвижностью. Количественно подвижность выражается величиной фактора удерживания R_f, определяе­мого выражением R_f = -X_i / X_эл,где X_i — расстояния от стартовой линии до середины соответствующе­го пятна i-го компонента после окончания разделения; Х_эя - длина пути элюента — расстояние от стартовой линии до итоговой линии фронта растворителя («в-в»).

Рис.4. Схема проведения тонкослойной хроматографии.

Тонкослойная хроматография используют как препаративный и аналитический методы, которые обеспечивают разделение и исследование биопроб с массой в пределах 10^-3...10^-12. Количественная тонкослойная хроматография включает в себя два оди­наково важных этапа: разделение смеси веществ и их качественное или количественное определение, которые удачным образом совмеща­ются в едином процессе. Препаративная тонкослойная хроматография используется для выде­ления всех классов веществ (от 1 мг до 10 г) из сложных смесей. Раз­деленные компоненты в виде пятен на пластинке можно затем иденти­фицировать другими аналитическими методами: спектрофотометрией в УФ, видимой и ИК-областях спектра, ЯМР-спектроскопией, масс-спектрометрией и др.

Преимущества тонкослойная хроматография перед колоночной хроматографией заключаются в следующем:

· простота и легкость исследования;

· исключение предварительной подготовки биопробы, поэтому анализу могут подвергаться смеси природных или синтетических ее единений;

· дешевый универсальный сорбент — силикагель и пластинки од­норазового использования;

· возможность нанесения одновременно нескольких биопроб;

· быстрота анализа;

· возможность непосредственного наблюдения за процессом элюирования и простота интерпретации результатов;

· возможность создания отчетных документов, например, путем фотографирования пластинок;

· низкая стоимость оборудования.

Можно выделить следующие стадии технологи­ческой процедуры исследования для тонкослойной хроматографии:

Подготовка биопробы в соответствии с методикой анализа.

2. Подготовка пластинки. В зависимости от назначения тонкослойной хроматографии (анализ или препаративное разделение) применяют пластинки со слоя­ ми сорбента различной толщины: пленки для количественного определения обычно имеют слой толщиной 0,1 или 1,3 мм, для препаративных целей — 0,5 и 2 мм. При необходимости сорбенты закрепляют на пластинках при помощи органических связующих материалов.

3. Подготовка хроматографической камеры. Обычно разделение проводят в среде, насыщенной парами элюента, поэтому в камеру, выложенную по стенкам фильтровальной бумагой, помещают элюент (высота слоя 1 см) и, покачивая камеру, смачивают листы бумаги.

4. Нанесение биопробы. Для отбора необходимого объема (1...5 мкл) капилляр погружают в раствор биопробы, избыток раствора уда­ляют с помощью фильтровальной бумаги. Затем капилляром осторож­но касаются слоя сорбента на стартовой линии, при контакте образуется круглое пятно (диаметр пятна не должен превышать 2 мм, так как при проявлении пластинки пятна размываются вследствие броуновско­го движения молекул вещества). Для отбора проб используют тонкие капилляры (с внутренним диаметром 0,5 мм), микрошприцы объемом 5...10 мкл, дозирующие шприцы с фиксированным объемом или специальные аппликаторы.

5. Проявление хроматограммы. В камеру помещают пластинку, причем стартовая линия не должна быть погружена в растворитель. По достижении фронтом растворителя высоты 10—15 см пластинку извлекают и отмечают положение фронта.