Сущность, значение и техника окраски по Цилю-Нильсену.

1. Бактерии, содержащие большое количество жиро- и воскоподобных веществ, а также миколовую кислоту в клеточной стенке и цитоплазме (туберкулезные и лепрозные палочки), являются кислотоустойчивыми и не могут быть окрашены простыми методами. Их окрашивают по методу Циля-Нильсена.

2. При окраске бактерий по методу Циля-Нильсена используют концентрированные растворы, содержащие протравы (5 % карболовый фуксин Циля) и ведут окраску при подогревании. Карболовая кислота разрыхляет клеточную стенку и повышает ее тинкториальные свойства. Высокая концентрация красителя и нагревание усиливают реакцию его взаимодействия с миколовой кислотой. Затем препарат обесцвечивают 5 % раствором серной кислоты и докрашивают метиленовым синим по Леффлеру. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет (цвет фуксина), т.к. миколовая кислота вступает во взаимодействие с карболовым фуксином. В результате краска фиксируется в микробной клетке, поэтому кислотоустойчивые палочки не обесцвечиваются серной кислотой. Остальные бактерии обесцвечиваются и докрашиваются в синий цвет метиленовым синим. Благодаря этому кислотоустойчивые бактерии могут быть дифференцированы от других.

3. Техника окраски по Цилю-Нильсену. Фиксированный мазок покрывают фильтровальной бумагой, на которую наливают карболовый фуксин Циля. Затем мазок подогревают над пламенем горелки до появления паров. Добавляют новую порцию красителя и повторяют манипуляцию в течение 3-5 минут. Снимают бумажку пинцетом и после охлаждения до комнатной температуры тщательно промывают мазок водой. Обесцвечивают мазок 5 % раствором серной кислоты, опуская в него предметное стекло на 20-30 минут. Затем препарат тщательно промывают водой. В течение 5 минут окрашивают раствором метиленового синего по Леффлеру, промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.

СТРОЕНИЕ, ОБРАЗОВАНИЕ, ЗНАЧЕНИЕ И МЕТОДЫ ОКРАСКИ СПОР У БАКТЕРИЙ.

1. Спорообразование свойственно не всем бактериям. Споры образуют почти исключительно палочковидные бактерии. Среди кокков споры образуют энтерококк и мочевая сарцина, и только один из вибрионов образует спору при температуре 45-55° С.

2.Спорообразующие аэробные палочки, у которых размеры споры не превышают диаметра клетки, называются бациллами (возбудитель сибирской язвы). Спорообразующие анаэробные бактерии, у которых размер споры превышает диаметр клетки, называются клостридиями (возбудители столбняка, ботулизма, газовой гангрены).

3. Споры образуются внутри тела бактерии, т.е. эндогенно при неблагоприятных внешних условиях (недостаток питательных веществ, наличие вредных продуктов обмена, высушивание, изменение аэрации, неблагоприятная температура). Одна бактериальная клетка способна образовывать только одну спору. Т.о., споры являются приспособлением к перенесению неблагоприятных условий, а не служат для размножения (исключение – актиномицеты).

4. В отличие от вегетативных форм, которые являются активной стадией бактериальной клетки, когда энергично проявляются все физиологические и биохимические процессы, спора – это покоящаяся форма, в которой отсутствуют ферментативная и другие виды активности и которая обладает высокой устойчивостью к действию повреждающих факторов, что обусловлено определенными физико-химическими и биологическими особенностями спор. Они могут сохранять свою жизнеспособность в течение длительного времени (например, споры возбудителей сибирской язвы и столбняка способны сохраняться в почве десятки лет). Образование спор способствует сохранению вида.

5. Образование спор у патогенных микробов происходит вне организма человека и животных; у одних микробов – при хорошем доступе кислорода; у других – при отсутствии кислорода. К спорообразованию способны только зрелые клетки бактерий.

6. Процесс спорообразования протекает в течение 18-20 часов следующим образом: в цитоплазме появляется уплотненный участок, окружающий нуклеоид; он обособляется от основной цитоплазмы при помощи цитоплазматической мембраны и образуется проспора, а затем формируется многослойная оболочка. Цитоплазматическая мембрана обрастает проспору, и образуется двойная мембрана. Между мембранами образуется кортекс из пептидогликана, а сверху спора покрывается оболочкой, пропитанной жирами, смолистыми веществами и дипиколинатом кальция. Вегетативная часть клетки лизируется, и спора освобождается. Наружный слой оболочки споры трудно проницаем для воды и различных веществ, а из внутреннего слоя при прорастании споры образуется клеточная стенка бактерии.

7. Химический состав споры характеризуется незначительным количеством свободной воды (цитоплазма сгущена по сравнению с вегетативной клеткой и содержит воду в связанном состоянии), большим содержанием липидов. Плотная многослойная оболочка обусловливает высокую устойчивость спор к воздействию неблагоприятных физических и химических факторов – высушиванию, воздействию УФ лучей, замораживанию и кипячению, действию спиртов и других химических веществ. Термоустойчивость спор связывают с наличием в оболочке дипиколината кальция. Споры погибают в автоклаве при 120° С в течение 15-20 минут и при действии сухого жара (150-170° С) в течение 1-2 часов.

8. Спорообразование, форма и расположение спор в клетке являются довольно постоянным видовым признаком бактерии, что позволяет отличать их друг от друга. Форма спор может быть круглой или овальной. Расположение спор в клетке бывает: центральное (сибиреязвенная бацилла); терминальное – на конце палочки (возбудитель столбняка); субтерминальное – ближе к концу палочки (возбудитель ботулизма, газовой гангрены). Диаметр споры обычно не превышает поперечника палочки, и форма клетки в процессе спорообразования не изменяется (сибиреязвенная бацилла). Однако спора может быть шире поперечника клетки, и если она располагается в центре клетки, палочки приобретают веретеновидную форму (возбудитель газовой гангрены), а если спора находится на конце клетки, то она приобретает форму барабанной палочки (возбудитель столбняка).

9. В благоприятных условиях спора прорастает и превращается в вегетативную форму, проходя три стадии: активацию, инициацию и вырастание. При этом из споры в течение 4-5 часов образуется одна бактериальная клетка. Активация – готовность к прорастанию. Она ускоряется после прогревания при температуре 60-80° С. Инициация длится несколько минут. Вырастание характеризуется быстрым ростом, оболочка споры набухает за счет поглощения воды, а затем внутри споры усиливается активность ферментов, гидролизующих оболочку споры, и в образовавшееся отверстие выходит наружу бактериальный проросток, одетый в тонкую оболочку. Из него формируется вегетативная клетка, приступающая к размножению.

10. Малая проницаемость оболочки спор является причиной того, что при обычных методах окраски они остаются бесцветными. В неокрашенном состоянии спора сильно преломляет свет и видна внутри или вне бактериальной клетки в виде блестящего тельца.

Для окраски спор используют энергичные воздействия, приводящие к разрыхлению оболочки – сильные красители (5 % карболовый фуксин Циля) и подогревание. Медленно воспринимая краску, спора после этого с трудом отдает ее обесцвечивающим растворам (5 % H₂SO₄). При окраске спор по методу Ожешки, оболочку споры протравливают действием HCl при подогревании. Приготовленный мазок высушивают, но не фиксируют. На мазок наливают 0,5 % раствор HCl, подогревают 1-2 минуты и сливают кислоту. Мазок промывают водой, просушивают, фиксируют над пламенем спиртовки. Далее окраску ведут методом Циля-Нильсена. Споры после обработки серной кислотой не обесцвечиваются и имеют красный цвет, а вегетативные формы после обесцвечивания докрашиваются метиленовым синим и имеют синий цвет.

11. В природе споровые микробы имеют широкое распространение: они встречаются в воздухе, воде, особенно в почве. Среди споровых бактерий имеются и болезнетворные.

О спорообразовании того или иного возбудителя инфекции надо хорошо знать, т.к. в связи с высокой резистентностью спор методы борьбы с инфекциями намного усложняются и применяются специальные способы стерилизации.

О жизнедеятельности и широком распространении споровых бактерий необходимо постоянно помнить при изготовлении лекарственных препаратов, растворов для подкожного или внутривенного введения, а также при заготовке перевязочного материала.

12. Способность к спорообразованию является довольно стойким видовым признаком целого ряда палочковидных бактерий. Но при некоторых условиях могут быть получены новые формы, навсегда утратившие способность к образованию спор. Например, Л. Пастером была получена неспорогенная вакцина из культуры бацилл сибирской язвы, выращиваемой при 42°С в течение 12-24 дней.