МЕТОД НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА — КиберПедия 

Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰)...

Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого...

МЕТОД НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА



Метод нокаута/нокина генов (т.е. удаления или добавления определенного гена или генов в геном организма) - это метод получения клеток или целых организмов (мышей), в которых целенаправленно разрушен определенный ген или встроен дополнительный ген. Для осуществления подобного необходимо иметь:

 

1) клонированный заданный ген;

2) два «методических» гена для селекции искомых клеток с удачно инактивированным геном и соответствующую селективную среду культивирования;

3) особую уникальную линию перевивных стволовых эмбриональных мышиных клеток - ES (embryonic stem cell line), сохраняющих способность дифференцироваться в надлежащих условиях во все типы клеток организма мыши, включая гаметы;

4) здоровых мышей и трудолюбие примерно на год упорной работы.

Эванс, Кауфман и соавт. опубликовали в «Nature» работу о выведении перевиваемой (трансформированной) линии эмбриональных стволовых клеток - ES (embryonic stem cells). Независимо от них аналогичную работу выполнил G. Martin и опубликовал ее в том же

1981 г. в PNAS. Эти перевивные линии клеток авторы получили из эмбрионов мышей на самых ранних стадиях развития - стадиях бластулы, выводя их в культуру на подслой фидерных клеток - эмбриональных фибробластов в присутствии факторов, подавляющих дифференцировку (например, LIF - leukemia inhibitory factor).

Позже разные авторы вывели несколько линий и сублиний ES (D3, CCE, AB-1, E14TG2a, J1, R1, HM-1 и др.). Данные клетки используют для создания мутантных мышей - с отсутствием определенного гена (генетический нокаут) или с введением лишнего гена (генетический нокин) в исследовательских целях. Массовый характер работы по генетическому нокауту приняли с 1991 г. Работы по выведению эмбриональных стволовых клеток человека имеют место, но в настоящее время такие работы «не принимают» в ответственном научном сообществе по двум причинам:

1) всегда подозревается трансформированность перевиваемых in vitro клеток, т.е. возможность их опухолевого перерождения, что для подавляющего большинства биологов и медиков является абсолютным запретом на применение эмбриональных стволовых клеток у людей;

 

2) в настоящее время нет благоразумных аргументов для оправдания работ по созданию запланированных кем бы то ни было людей-мутантов, аналогичных мышам с генетическим нокаутом или нокином.

Методики удаления/встраивания генов основаны на природном феномене гомологичной рекомбинации. При половом размножении живых организмов природа «предусмотрела» мейоз и кроссинговер в мейозе, при котором происходят физическое сближение гомологичных генов в гомологичных хромосомах и обмен участками ДНК между гомологичными генами. Оказывается, если в клетку ввести отдельный ген, то он тоже в состоянии найти в хромосомах гомологичный себе ген (одноименный) и вступить с ним в гомологичную рекомбинацию, т.е. произвести обмен участками ДНК. Для направленного мутагенеза (или нокаута) заданного гена в клетку вводят не интактный гомологичный ген, а умышленно поврежденный. Дальше все происходит по природным механизмам: поврежденный, но гомологичный экзоген находит одноименный интактный клеточный ген, вступает с ним в гомологичную рекомбинацию, и в результате в хромосоме на месте прежнего интактного гена появляется поврежденный «подлог». Цель достигнута.



Учитывая выдающиеся возможности этой методики, опишем ее подробнее. В качестве «методических» генов используют обычно два - ген резистентности к неомицину neor и ген вирусной тимидинкиназы из вируса простого герпеса HSV-tk. Если в некой клетке есть ген neor, то такая клетка способна жить в присутствии препарата - аналога неомицина G418. Клетки, не имеющие гена neor, погибают в присутствии G418. Если в клетке есть вирусный ген HSV-tk, то такая клетка погибнет при добавлении в среду культивирования противовирусного препарата ганцикловира. Клеткам, не имеющим гена HSV-tk, ганцикловир не страшен.

 

Сначала в ДНК препарата заданного гена (т.е. in vitro), примерно в середину последовательности, встраивают ген neor. Сбоку на некотором расстоянии помещают ген HSV-tk. Это и есть экзогенетическая конструкция, необходимая и достаточная для попытки направленного мутагенеза в какой-либо клетке. Для «создания» целой мыши без заданного гена используют клетки линии ES. В них трансфицируют описанную выше генетическую конструкцию, клетки помещают в селективную культуральную среду, содержащую G418 и ганцикловир.



Возможны 3 варианта внутриклеточной «судьбы» экзогенетической конструкции:

1) она не встраивается в хромосомы и бесследно теряется при делении клетки; такие клетки, просто ES, погибают в селективной среде от отравления препаратом G418;

2) экзогенетическая конструкция встраивается на случайные места в геноме; она, как правило, сохраняет свою целостность, несет и ген neor, и ген HSV-tk; такие клетки тоже погибают в селективной среде, но под действием ганцикловира;

3) экзогенетическая конструкция находит гомологичный клеточный ген и вступает с ним в гомологичную рекомбинацию: эти клетки и есть искомые; «хвост» с геном HSV-tk (он вне гомологичной области) выщепляется и теряется при делении клетки; ген neor, поскольку он расположен в середине гомологичной последовательности ДНК, как раз оказывается встроенным в хромосому; в результате искомые клетки несут ген neor, но не несут ген HSV-tk и поэтому способны жить и делиться в селективной среде, содержащей и G418, и ганцикловир; такие клетки и выделяют из массы остальных.

В описанном варианте направленный мутагенез, или нокаут гена, произошел на одной из гомологичных хромосом. Его можно выполнить и на обеих гомологичных хромосомах, для чего нужны еще два других «методических» гена для селекции. Но мышей с нокаутом гена можно получить и в случае нокаута одного из гомологичных генов в клетках ES следующим образом. От «свежезабеременевшей» мыши выделяют эмбрионы на стадии бластулы или морулы (или проводят оплодотворение in vitro). В эти ранние эмбрионы инъецируют одномутированные клетки ES и имплантируют их в матку подготовленной псевдобеременной самке. Из такой сконструированной бластулы развиваются здоровые (по мышиным меркам) эмбрионы, рождаются мышата-мозаики, часть клеток которых во всех тканях, включая половые клетки, происходит из одномутированных клеток ES. Поскольку половые клетки гаплоидны, то часть из них несет в «чистом виде» нокаутированный ген.

 

Подобных мышат используют для инбредного размножения, и в потомстве второго поколения какая-то часть мышат обязательно получается гомозиготной по нокаутированному (испорченному) гену. Это и есть конечная цель работы. Чтобы удостовериться в правильности полученного результата, выполняют контрольную ПЦР на ген neor.

Таких мышей размножают инбридингом и получают необходимое и достаточное для запланированной работы число особей с заданным генетическим нокаутом (т.е. с отсутствием функционально дееспособного гена).

Генетический нокаут возможен только в отношении генов, отсутствие которых позволяет организму развиться, родиться и начать жить. Если какой-то ген абсолютно необходим для реализации онтогенеза организма, то нокаут по данному гену осуществим в перевиваемых in vitro клетках, и в какой-то мере на моделях in vitro исследуемы последствия отсутствия гена для жизнедеятельности клетки.

Вышеперечисленным потенциал метода не исчерпывается. Можно получить библиотеку экзогенов, в которых «методический» ген (а именно его внедрение и нарушает генетический код, т.е. является мутирующим фактором) повреждает разные участки исследуемого гена. Одним из генов библиотеки производят нокаут. Затем в отдельные «нокаутированные» клетки трансфицируют интактный ген (если происходит реставрация экспрессии соответствующего белка, то она доказывает «от противного»: исходно сделанный нокаут был истин-

ным), а также (по одному) разные гены из библиотеки поврежденных генов. Анализируют, не произойдет ли реставрация экспрессии продукта в случае ретрансфекции каких-то генов из поврежденных. Таким образом, удается установить функциональную нагрузку различных участков одного гена.

Существенные усовершенствования в методы генетического нокаута внесли работы B. Sauer (1993), N.J. Kilby и соавт. (1993), H. Gu и K. Rajewsky (1993) и других исследователей, первыми использовавших сайтспецифичную рекомбиназу Cre (Causes recombination), выделенную Sauer из бактериофага Р1. Если в геном мыши ввести ранее описанным методом «слева» и «справа» от интересующего гена сайты, специфичные для Cre, то вырезание гена (точнее, его инверсию и как следствие потерю функции) можно осуществить не в клетках ES, а в любой момент онтогенеза, т.е. у мышей в любом возрасте. Последовательность нуклеотидов, узнаваемая Cre, носит название LoxP (locus of X-over P1) и состоит из 34 пар оснований, включающих 13 пар инвертированных повторов по краям: ATAACTTGGTATAGCATACAT-TATACGAAGTTAT.

 

Систему «LoxP-Cre» используют и в модели трансгенных мышей. Таким образом, существуют способы тканеспецифичного выключения заданного гена в заданный момент онтогенеза. Это весьма трудоемкие работы, но их познавательная ценность сегодня кажется огромной.

Трансгенная мышь есть мышь, в чей геном введен посторонний ген (экзоген). Чтобы «сделать» трансгенную мышь, необходимо иметь в качестве препарата чистую ДНК, строго воспроизводящую последовательность нуклеотидов заданного экзогена (как минимум). Обычно к ДНК экзогена с определенным смыслом пристраивают еще регуляторные последовательности ДНК-промоторы и энхансеры. Получают вектор экспрессии в виде кольцевой ДНК (фактически - искусственный вирус).

«Готовят» мышь-самку: ей вводят фолликулостимулирующий гормон и хорионический гонадотропин для индукции суперовуляции. Такую самку спаривают с самцом, после чего у самки быстро извлекают оплодотворенные яйцеклетки. Микроманипулятором в мужской пронуклеус инъецируют ДНК экзогена в дозе несколько сот копий, и такие яйцеклетки имплантируют в матку или яйцеводы другой подготовленной псевдобеременной самки. И ждут от нее потомства. Опыт показывает, что примерно 25% новорожденных мышат несут

экзоген (теперь уже трансген) в своем геноме. Экзогены ковалентно встраиваются (интегрируются) в одно или в несколько десятков мест собственного генома мыши (кстати, как ретровирусы типа ВИЧ). Если в собственном геноме нет генов, гомологичных экзогену, то встраивание экзогена происходит в случайные места генома.

Встраивание осуществляется очень быстро после ввода экзогенной ДНК в пронуклеус - до первой репликации ДНК зиготы, так как большинство мышей, получивших экзоген (75%), имеют его в каждой клетке своего тела, включая гаметы. Интересно, но факт: встраивание чужеродной ДНК в геном в большинстве случаев допускает нормальное развитие и рождение организма, разумеется, если трансген не кодирует синтез токсичного для организма белка. В первом поколении мышей трансген находится в гетерозиготном состоянии. Таких мышей спаривают, и во втором поколении отбирают гомозигот по трансгену. Вот они уже и есть полноценные трансгенные мыши.

 

Дополнение трансгена тканеспецифичными и/или индуцибельными промоторами позволяет манипулировать экспрессией трансгена по усмотрению экспериментатора (не во всех клетках; а только, например, в Т-лимфоцитах или только в β-клетках островков Лангерганса, не постоянно, а только после введения в организм индуктора). Таким образом, можно изучать как будут проходить развитие и жизнедеятельность организма при излишней экспрессии определенного гена (overexpression).






Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого...

Папиллярные узоры пальцев рук - маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни...

Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим...

Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰)...



© cyberpedia.su 2017 - Не является автором материалов. Исключительное право сохранено за автором текста.
Если вы не хотите, чтобы данный материал был у нас на сайте, перейдите по ссылке: Нарушение авторских прав

0.017 с.