Критерии интерпретации чувствительности гемофильной палочки диско-диффузионным методом на HTM агаре (NCCLS, 1999)

Критерии интерпретации чувствительности гемофильной палочки диско-диффузионным методом на HTM агаре (NCCLS, 1999)

Антибиотик	Диаметр зоны подавления роста, мм
	Резистентный	Умеренно резистентный	Чувствительный
Ампициллин (10 мкг)	18	19-21	22
Амоксициллин/клавуланат (20/10 мкг)	19	–	20
Меропенем (10 мкг) или	–*	–*	20
Имипенем (10 мкг)	–*	–*	16
Триметоприм/сульфаметоксазол (1,25/23,75 мкг)	10	11-15	16
Цефотаксим (30 мкг) или	–	–	26
Цефтриаксон (30 мкг), или	–*	–*	26
Цефтазидим (30 мкг)	–*	–*	26
Хлорамфеникол (30 мкг)	25	26-28	29
Азитромицин (15 мкг) или	–*	–*	12
Кларитромицин (15 мкг)	10	11-12	13
Тетрациклин (30 мкг)	25	26-28	29
Ципрофлоксацин (5 мкг)	–*	–*	21

* Резистентные штаммы не выделены.

 

Контроль качества определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят путем тестирования контрольных штаммов. В качестве контрольных используют штаммы Американской коллекции типовых культур (АТСС), отличающиеся генетической стабильностью и хорошо изученными фенотипическими характеристиками.

Для контроля качества при определении чувствительности гемофил на НТМ агаре используются штаммы H.influenzae ATCC 49247 и E.coli ATCC 35218 (при тестировании ингибиторозащищенных пенициллинов). Методика постановки и учета соответствует методике работы с испытуемым штаммом. Результаты оцениваются по критериям, изложенным в табл. 6.

Каждая серия чашек при постановке чувствительности должна проверяться на их пригодность для роста тестируемых микроорганизмов. Для этого используется контрольный штамм H.influenzae ATCC 10211, из суточной культуры которого готовят микробную взвесь, соответствующую по мутности 0,5 по МакФарланду. Из полученной микробной взвеси готовят серию последовательных разведений 1:10. Затем на приготовленные чашки со средой НТМ высевают по 0,1 мл взвеси -5, -6, -7 разведений. При хороших питательных свойствах агара должен отмечаться рост микроорганизмов из -6 и -7 разведений.

Таблица 6.

Допустимые диапазоны значений диаметров зон подавления роста для контрольных штаммов H.influenzae

ATCC 49247 и E.coli ATCC 35218 (NCCLS, 1999)

Антибиотик	H.influenzae АТСС 49247	E.coli АТСС 35218
Ампициллин (10 мкг)	13-21	–
Амоксициллин/клавуланат (20/10 мкг)	15-23	18-22
Триметоприм/сульфаметоксазол (1,25/23,75 мкг)	24-32	–
Меропенем (10 мкг)	20-28	–
Имипенем (10 мкг)	21-29	–
Цефотаксим (30 мкг)	31-39	–
Цефтриаксон (30 мкг)	31-39	–
Хлорамфеникол (30 мкг)	31-40	–
Азитромицин (15 мкг)	13-21	–
Кларитромицин (15 мкг)	11-17	–
Тетрациклин (30 мкг)	14-22	–
Ципрофлоксацин (5 мкг)	34-42	–

 

Определение минимальной подавляющей концентрации

Метод серийных разведений в бульоне

Макрометод

Метод серийных разведений в бульоне (макрометод) позволяет определить МПК без значительных материальных затрат. Тестирование небольшого количества штаммов в рутинной практике целесообразно выполнять макрометодом.

Материалы:

1) стерильный НТМ бульон; можно использовать готовый коммерческий НТМ бульон или приготовленный в лаборатории на основе стерильного бульона Мюллера–Хинтона со стабилизированным катионным составом (по ионам Са⁺⁺, Мg⁺⁺) c добавлением тех же компонентов, что и в НТМ агаре;

2) субстанции антибиотиков с известной активностью;

3) стерильные пробирки размером 13x100 мм или 14x140 мм;

4) стерильные пипетки;

5) дозирующие пипетки со стерильными наконечниками;

6) стандарт мутности 0,5 по МакФарланду.

Процедура. Тестирование проводится в объеме 1 мл каждого разведения антибиотика с конечной концентрацией гемофильной палочки примерно 5x10⁵ КОЕ/мл.

Приготовление серийных разведений антибиотика. Серийные разведения антибиотика готовятся из "стартового" раствора на НТМ бульоне (табл. 7), который затем разливается по 0,5 мл в каждую пробирку. В последующем при внесении тестируемой бульонной культуры H.influenzae концентрация антибиотика уменьшается в 2 раза. Количество пробирок определяется необходимым диапазоном разведений антибиотика и увеличивается на две для постановки "отрицательного контроля" и "контроля роста".

Таблица 7.

Микрометод

В случае необходимости определения МПК у 8 и более штаммов целесообразно использовать микрометод. Он позволяет тестировать одновременно большое количество штаммов к нескольким антибиотикам.

Тестирование проводится в объеме 0,1 мл (0,05 мл НТМ бульона и 0,05 мл инокулюма), что позволяет значительно сократить количество расходного материала. Методика не имеет отличий от макрометода, за исключением объема, но требует дополнительного оснащения лаборатории многоканальными пипетками, микротитровальными плашками (с круглым или коническим дном) со стерильными крышками, специальным устройством с непрямой подсветкой для учета результатов.

Рост микрофлоры в присутствии антибиотика сравнивается с ростом культуры в ячейке без антибиотика.

Каждая партия тестируемых штаммов сопровождается внутренним контролем с использованием контрольных штаммов H.influenzae ATCC 49247 и E.coli ATCC 35218.

Метод Е-тестов

Е-тест представляет собой пластиковую полоску размером 5x50 мм c нанесенным градиентом концентрации антибиотика (0,002–32, 0,016–256 или 0,063–1024 мг/л в зависимости от препарата). Метод основан на диффузии антибиотиков в агар, что создает градиент концентрации антибиотика в агаре. Зона задержки роста имеет форму эллипса, размеры которого увеличиваются от меньшей концентрации антибиотика на полоске к большей.

Материалы:

1) НТМ агар, приготовленный в лаборатории, или коммерческие готовые чашки с агаром;

2) полоски Е-тестов с антибиотиками;

3) стерильный бульон Мюллера–Хинтона;

4) стандартные стерильные тампоны;

5) стандарт мутности 0,5 по МакФарланду.

Процедура приготовления НТМ агара и нанесения культуры аналогична таковой при диско-диффузионном методе. Поверхность микробного газона должна быть сухой, для чего Е-тесты наносят не ранее, чем через 15 мин от момента нанесения инокулюма. Полоски Е-тестов помещаются на поверхность агара пластиковой поверхностью с отметками градиента концентраций кверху. На чашку диаметром 90 мм наносят не более 2 полосок. Посевы инкубируют в течение 20–24 ч при температуре 35^оС в атмосфере с повышенным содержанием СО₂.

Учет результатов. Результаты следует учитывать только при наличии сплошного плотного газона культуры. Если рост слабый, необходимо продлить инкубацию. В случае "разреженного" роста газона тестирование нужно повторить, проверив качество агара и инокулюма. Результаты учитываются в отраженном свете и/или под лупой, чтобы хорошо рассмотреть край роста. Учитывается зона полного подавления роста. Величина МПК определяется тем значением концентрации, на уровне которой эллипс пересекается со шкалой полоски.

Интерпретация. Метод Е-тестов определяет МПК исходя из непрерывного градиента концентраций, включая значения между двукратными разведениями. Для определения категории чувствительности полученные значения следует округлять до ближайших значений двукратных разведений. Например:

1) для чувствительных штаммов значения МПК ампициллина Ј1 мг/л; методом Е-тестов получена МПК 0,064 мг/мл, результат интерпретируется как чувствительный;

2) МПК умеренно резистентных штаммов – 2 мг/л; методом Е-тестов определена МПК 1,5 мг/л, результат интерпретируется как умеренно резистентный.

Критерии интерпретации результатов определения чувствительности к некоторым антибиотикам методом разведений и Е-тестов приведены в табл. 8.

Таблица 8.

Критерии интерпретации чувствительности H.influenzae методом разведений и E-тестов

(NCCLS, 2000)

Антибиотик	МПК, мг/л
	Резистентный	Умеренно резистентный	Чувствительный
Ампициллин	4	2	1
Амоксициллин/клавуланат	4/2	–	2/1
Триметоприм/сульфаметоксазол	4	1	0,5
Цефтриаксон или цефотаксим, или цефтазидим	–*	–*	2
Меропенем или	–*	–*	0,5
Имипенем	–*	–*	4
Хлорамфеникол	8	4	2
Азитромицин или	–	–*	4
Кларитромицин	32	16	8
Тетрациклин	8	4	2
Ципрофлоксацин	–*	–*	1

* Резистентных штаммов не выделено.

Контроль качества. Используются штаммы H.influenzae ATCC 49247, H.influenzae ATCC 49766 (при тестировании карбапенемов) и E.coli ATCC 35218 (при тестировании ингибиторо-защищенных пенициллинов). Методика постановки и учета соответствует методике работы с испытуемым штаммом. Результаты интерпретируются по приведенным ниже критериям (табл. 9).

Таблица 9.

Приложение 1

1.1. Шоколадный агар для выделения и идентификации H.influenzae

Состав: 2% мясопептонный агар (МПА), 10% крови и 5% дрожжевого экстракта от объема МПА, рН 7,4–7,6.

Приготовление. К охлажденному до температуры 75^оС МПА асептически добавляют половину необходимого объема крови, тщательно перемешивают и нагревают в течение 3–5 мин на водяной бане при температуре 80^оС, непрерывно помешивая. Затем остужают при комнатной температуре до 75^оС, добавляют вторую часть крови и снова нагревают в течение 3–5 мин, непрерывно помешивая. Остужают при комнатной температуре до 45–50^оС и добавляют дрожжевой экстракт. Агар тщательно взбалтывают и разливают по пробиркам и/или чашкам Петри.

Готовую питательную среду хранят в холодильнике, избегая высушивания, не более 2 нед.

 

Шоколадный бульон

Основа – питательный бульон (рН 7,4–7,6). Приготовление аналогично приготовлению шоколадного агара.

Пример: на 180 мл питательного бульона добавляют 18 мл крови (9 мл эритоцитной массы и 9 мл сыворотки крупного рогатого скота) и 9 мл дрожжевого экстракта.

 

Приложение 2

Приложение 3

Определение мочевины

Используются 2 реактива.

Реактив А: стерильная дистиллированная вода – 4 мл, этиловый спирт 96% – 2 мл, мочевина – 2 г.

Реактив В: 0,2% раствор фенол-рот – 1 мл, KH₂PO₄ – 0,1 г, K₂HPO₄ – 0,1 г, NaCl – 0,5 г, дистиллированная вода – 100 мл.

Приготовление. Реактив А хранится при температуре 4–10^оС (не автоклавировать!). Реактив В стерилизуют при 1,5 атм. 30 мин. Перед употреблением ex tempore смешать 1 часть реактива А и 19 частей реактива В.

 

Приложение 4

Приготовление НТМ агара

После растворения основы в нее добавляют дрожжевой экстракт до конечной концентрации 5 мг/мл и раствор гематина до конечной концентрации 15 мг/л. Для приготовления основного раствора гематина к 50 г порошка добавляют 100 мл 0,01N NaOH (0,01 моль/л) и нагревают при тщательном перемешивании до полного растворения.

В подготовленную для автоклавирования среду на 1 л вносят 30 мл основного раствора гематина. После автоклавирования и охлаждения основы на водяной бане до температуры 45–50^оС в нее асептически вносят матричный раствор НАД 3 мл на 1 л агара до конечной концентрации 15 мг/л.

Для приготовления матричного раствора 50 мг НАД растворяют в 10 мл дистиллированной воды и стерилизуют фильтрацией через мембранные фильтры с размером пор 0,45 мкм.

При тестировании триметоприма или ко-тримоксазола следует дополнительно асептически добавить 0,2 МЕ/мл тимидинфосфорилазы.

Приготовленный агар разливают в стерильные чашки Петри на ровном, строго горизонтальном рабочем столе. На чашку диаметром 100 мм необходимо 25 мл агара, диаметром 90 мм – 20 мл, для того чтобы толщина агара в чашке была 4±0,5 мм.

Агар застывает при комнатной температуре. Чашки с застывшим агаром необходимо подсушить с приоткрытыми крышками в термостате при температуре 35^оС в течение 10–30 мин, чтобы удалить избыток конденсата.

 

Критерии интерпретации чувствительности гемофильной палочки диско-диффузионным методом на HTM агаре (NCCLS, 1999)

Антибиотик	Диаметр зоны подавления роста, мм
	Резистентный	Умеренно резистентный	Чувствительный
Ампициллин (10 мкг)	18	19-21	22
Амоксициллин/клавуланат (20/10 мкг)	19	–	20
Меропенем (10 мкг) или	–*	–*	20
Имипенем (10 мкг)	–*	–*	16
Триметоприм/сульфаметоксазол (1,25/23,75 мкг)	10	11-15	16
Цефотаксим (30 мкг) или	–	–	26
Цефтриаксон (30 мкг), или	–*	–*	26
Цефтазидим (30 мкг)	–*	–*	26
Хлорамфеникол (30 мкг)	25	26-28	29
Азитромицин (15 мкг) или	–*	–*	12
Кларитромицин (15 мкг)	10	11-12	13
Тетрациклин (30 мкг)	25	26-28	29
Ципрофлоксацин (5 мкг)	–*	–*	21

* Резистентные штаммы не выделены.

 

Контроль качества определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят путем тестирования контрольных штаммов. В качестве контрольных используют штаммы Американской коллекции типовых культур (АТСС), отличающиеся генетической стабильностью и хорошо изученными фенотипическими характеристиками.

Для контроля качества при определении чувствительности гемофил на НТМ агаре используются штаммы H.influenzae ATCC 49247 и E.coli ATCC 35218 (при тестировании ингибиторозащищенных пенициллинов). Методика постановки и учета соответствует методике работы с испытуемым штаммом. Результаты оцениваются по критериям, изложенным в табл. 6.

Каждая серия чашек при постановке чувствительности должна проверяться на их пригодность для роста тестируемых микроорганизмов. Для этого используется контрольный штамм H.influenzae ATCC 10211, из суточной культуры которого готовят микробную взвесь, соответствующую по мутности 0,5 по МакФарланду. Из полученной микробной взвеси готовят серию последовательных разведений 1:10. Затем на приготовленные чашки со средой НТМ высевают по 0,1 мл взвеси -5, -6, -7 разведений. При хороших питательных свойствах агара должен отмечаться рост микроорганизмов из -6 и -7 разведений.

Таблица 6.