Технология выделения и очистки ферментных препаратов

Выделение и отчистка фермента как из культуры микроорг-ма (выращенного любым способом), так и из др. природных источников весьма трудоёмкий и дорогостоящий процесс, поэтому, если фермент можно использовать в виде неочищ. препарата, его не очищают. В пром. широко применят коммерческие препараты ферментов, чистота которых составляет 0.1% (т.е. 99% составляют примеси). В большинстве отраслей пищ. пром., практике научных исследований и особенно в медицине исп-ют только очищ. препараты ферментов, частично или полностью освобождённые от балластных вещ-в и полностью охарактеризованные в отношении их специфичности и физико-хим. св-в. Исходным материалом для получения препаратов ферментов служат: биомасса продуцента, фильтрат культурной жид., экстракт из культуры микроорг-ма или из тканей и органов раст. и животных, из которых готовят препараты различной степени очистки.

Неочищ. ферментные препараты получают путём высушивания в мягком режиме культуры микроорг-ов вместе с остатками пит. среды. Такие препараты получают и путём упаривания экстракта из культуры продуцента, выращ. поверхностным способом или из фильтрата культуральной жидкости (в случае глубинного выращивания микроорг-ов). Распространён также метод ацетоновых порошков, состоящий в осаждении и быстром обезвоживании при t не выше -10 ℃ тканей или вытяжек из них.

Для успешного выделения ферментов из кл-го содержимого необходимо очень тонкое измельчение исходного материала вплоть до разрушения субкл-х структур: лизосом, митохондрий, ядер и др., которые имеют в своём составе многие индивидуальные ферменты. Для этого исп-ют спец. мельницы и гомгенизаторы, а также ультразвук, метод попеременного замораживания и оттаивания тканей. Для высвобождения ферментов из мембранных структур кл. к гомогенизаторам добавляют небольшое кол-во детергентов или обрабатывают их энзимами.

В зависимости от св-в выделяемого фермента и сопутствующих ему биомастных вещ-в, при получении очищ. препаратов ферментов комбинируют различные приёмы и методы такие как: термическое фракционирование, осаждение орг. р-рителями, солями и тяж. метал., фильтрация на молекулярных ситах, ионообменная хроматография, электрофорез, изоэлектрофокусирование.

На заключительных этапах очистки часто исп-ют аффинную хроматографию, которая основана на способности ферментов избирательно связывать те или иные лиганды – субстраты, коферменты, конкурентные ингибиторы, аллотерические эффекторы и т.п. Такое связывание весьма специфично, что позволяет выделить тот или иной энзим из множества других б-ов.

Для синтеза аффиного сорбента соответствующего специфичности данного фермента, лиганд (субстрат или его аналог) присоединяют к инертной матрице. Для уменьшения пространственных трудностей при взаимодействии фермента с матрицей лиганд присоединяют к носителю через промежуточное звено (вставку, ножку, спейсер). Присоединение лигандов к поперечносшитой агарозе – сефарозе обычно проводят, активируя её бромцианом. Связывание с сефарозой, активирование бромцианом обеспечивает взаимодействие сорбента с каталитическим центром только карбоксипептидаз, благодаря сходству лиганда с субстратом карбокспептидазы.

Очищ. ферментные препараты хранят при низкой t (до - 80℃). Для стабилизации ферментов в их препараты добавляют коферменты и субстраты. Ферментные препараты для пром. применения стабилизируют, добавляя глицерин, моносахариды, дисахариды (глюкоза, сахароза, лактоза), НS – соединения (цистеин), отдельные аминокислоты, желатинц и др. б-и-наполнители.

Получение антибиотиков (ант-ов)

К ант-ам относятся низкомолекулярные эффекторы изначально природного происхождения, способные подавлять рост живых кл. В хим. отношении они представляют сборную группу орг. вещ-в. В зависимости от хим. природы и ряда других св-в известные ант-и делятся на ряд классов: β-Лактамные, тетрациклины, макролиды, аминогликозиды, гликопептиды, амфениколы, линкосамиды, полиеновые, противоопухолевые.

По типу действия ант-и делят на бактерицидные, вызывающие гибель микроорг-ов, и бактериостатические, нарушающие способность микроорг-ов делиться. По спектру действия различают ант-и узкого и широкого действия.

Наиболее яркая особенность ант-ов – исключительная специфичность их действия. Специфика действия их состоит в избирательном подавлении этими эффекторами одного или нескольких процессов лишь у некоторых микроорг-ов. Таким образом, ант-ик блокирует метаболические мишени в кл.-мишенях.

Методы получения ант-ов путём хим. синтеза чрезвычайно сложны и не могут конкурировать с их биосинтезом методом биотехнологии. Существует несколько способов получения как природных, так и полусинтетических ант-ов. Направленный биосинтез ант-ов осуществляется путём прямой ферментации микроорг-ма – продуцента с подходящим предшественником, что индуцирует синтез ферментов вторичного метаболизма в идиофазе.

Др. способ получения ант-ов состоит в исп-ии для их биосинтеза блокированных мутантов, у которых отсутствует (блокировано) определенное звено в цепи реакций, ведущих к синтезу ант-ка. Блокированные мутанты не способны образовать нужный ант-ик. Исп-я низкую субстратную специфичность ферментов вторичного метаболизма и вводя аналоги предшественников ант-ка, последние переводят в аналоги самого ант-ка в ходе процесса, известного как мутационный биосинтез, или мутасинтез.

Ант-ки продуцируются плесневыми грибами, актиномицетами, эубактериями и др. микроорг-ми.

В процессе преобразования ант-ов задействовано значительное число генов. Массовая расшифровка первичной структуры геномов микроорг-ов показала, что эта величина равна 1-2%. С др. стороны, это обстоятельство затрудняет анализ путей биосинтеза ант-ов и идентификацию отдельных мутаций, способных увеличить выход продукта.

Биосинтез ант-ов, как и любых др. вторичных метаболитов, возрастает в фазе замедленного роста кл. популяции (конец трофофазы) и достигает максимума в стационарной фазе (идиофазе). Поэтому любые механизмы, тормозящие кл. пролиферацию и активный рост, стрессовой ситуации, активируют процесс образования ант-ов.

Процесс культивирования идиолитов проходит 2 фазы (двуступенчатое культивирование). На 1й фазе происходит накопление достаточного кол-ва биомассы, которая выращивается на среде для роста микроорг-ма. Эта фаза должны быть быстрой, а пит. среда дешёвой. На 2й фазе осуществляется запуск и активный синтез ант-ка. На этой фазе ферментацию ведут на продуктивной среде.

Образование ант-ов регулируется условиями культивирования микроорг-ов. Поэтому оптимизация пит. среды является главным фактором в повышении выхода продукта.

Многие ант-ки берут своё начало от промежуточных соединений обмена первичных метаболитов, поэтому их биосинтез регулируется путём ретроингибирования. Кроме него биосинтез многих ант-ов тормозится высокими концентрациями своих же ант-ов.

Большинство ант-ов получают при глубинной аэробной ферментации периодического действия в асептических условиях. Период ферментации длится 7-10 суток. В последние годы внедряются полунепрерывные и непрерывные процессы ферментации. Технология завершающих стадий процесса определяется природой ант-ка, характером производства и целями дальнейшего использования ант-ов. Для медицинских целей технология выделения и очистки имеет особое значение. Обычно она включает сложные многоступенчатые комбинации различных операций. Ант-ки выделяют или в виде сравнительно неочищенных препаратов (натриевая соль пенициллина), или в виде высокоочищенных вещ-в (прокаиновая соль пенициллина), предназначенных для клинического использования. Выход ант-ов обычно составляет несколько десятков граммов на литр.

«Красная» биотехнология

1. Биофармацевтика

Технолог. в биофармацевтике – технолог., связанные с разработкой инновационных препаратов на основе вещ-в, выделенных из биолог. ткани или культуры живых кл., характеризующихся сложной молекулярной структурой. Биопрепараты позволяют оказывать целевое воздействие действуя на геном.

Развитие биофармацевтики явл. стратегически важным направлением фармацевтической индустрии России, т. к. в основный части жизненно необходимых и важнейших препаратов импорт превышает 90%.

Достижения в сфере фармацевтических биотехнолог. последних лет позволяют проводить терапию заболеваний, ранее считавшихся не излечимыми (онкологии, ВИЧ-инфекции). Значительная часть биопрепаратов явл. специализированными лекарственными средствами, выписываемыми по рецепту и входят в группы наиболее дорогостоящих лекарств.

2. Биомедицина.

Биотехнолог. в медицине – технолог. и достижения в биохим., иммунологии, микробиолог. и др. биологических науках для решения задач технологии лечения и диагностики. Основными тенденциями и характеристиками современного развития биомедицины явл. её трансформация в сторону персонализированного и превентивного лечения. Такая медицина учитывает индивидуальные особенности при профилактике и лечении заболеваний.

Наиболее актуальные цели развития биомедицины в России: 1) снижение затрат на секвенирование генома до широкого распрстранеиния этой услуги; 2) ранняя диагностика заболеваний, в т.ч. выявл. наследственной предрасположенности к болезням; 3) определение индивидуальных генетически обусловленных особенностей реакции организма на лекарственные вещ-ва; 4) разработка методов лечения наследственных болезней; 5) методы диагностики инфекционных и неинфекционных заболеваний с помощью биочипов; 6) кл. терапия, тканевая инженерия и разработка методов выращивания органов для трансплантации.

«Белая» биотехнология

1. Биоэнергетика

Биотехнолог. в энергетике – технологии получения в пром. масштабах энерг. из различных видов возобновляемого сырья биолог. происхождения (жид., тв., г. топлива). Данное направление имеет важное значение для экономики России и нацелено на сокращ. зависимости от не возобновляемых источников энергии. В энергетической стратегии России до 2020 г. установлены след. цели: 1) сокращение потребления не возобновляемых топливно-энергетических ресурсов; 2) снижение эколог. нагрузки от деятельности топливно-энергетического комплекса, в частности снижение вредных выбросов от энергетических установок в городах и населённых пунктах со сложной эколог. обстановкой, а также в местах массового отдыха населения; 3) обеспечение децентрализованных потребителей и регионов с дальним и сезонным завозом топлива, в 1ю очередь – районы крайнего севера; 4) снижение расходов на дальнепривозное топливо.

Для достижения данных целей необходимо развитие возобновляемых источников энергии, среди которых не малую роль играет биоэнергетика в силу больших объёмов, разнообразия, дешевизны и доступности биомассы, из которой может быть произведена энергия.

В наст. время основными видами биотоплива для производства электро и тепловой энергии в России явл. торф и дрова. Потенциальная потребность в биогазе для замещения топлива и энергии для сельского населения России составляет 49 млр м³ в год.

2. Пищевая промышленность.

Пищ. биотехнология – битехнологические методы производства продуктов питания, направленные на улучшение кач-ва и безопасности пищ. сырья, повышение пит. ценности пищи, создание функциональных продуктов, способ-щих сохранению и укреплению здоровья. В числе приоритетных направлений развития пищ. биотехнологии в России можно выделить повыш. пищ. ценности отечественных продуктов питания.

Пищ. б. неживотного происхождения получают из семян масличных культур, водорослей за счёт бикробиолог. синтеза. В мире наиболее широко распространено производство соевого б-а. Перспективным источником явл. микроог-мы, чья производительность в сотни тыс. раз выше традиционных способов получения протеиновых вещ-в.

Снижение зависимости пищ. пром. от импорта сахара, повышение потребления сахаро- и крахмалосодержащих продуктов, обеспечение сырьём производства диетического питания для терапии сахарного диабета явл. важным развитием пищ. пром. России. Сезонность переработки основного сахаросодержащего сырья в сахарные сиропы определяет зависимость России от импортных поставок сахара-сырца. Технолог. получения альтернативных подсластителей глюкозо-фруктозных сиропов путём глубокой переработки зерновых позволяет исп-ть некондиционное сырьё и снизить себестоимость сахаристых продуктов.

Перспективным направлением пищ. биотехнологии явл. получение ферментов, которые представляют собой высокоактивные билогич. катализаторы, способствующие увеличению выхода, улучшению кач-ва и продлению срока хранения пищ. продукции.

3. Биохимия

Биотехнологии в хим. пром. включают в себя 2 направл.: технологии исп-я биомассы, как сырья для получения первичных и вторичных хим. компонент для производства продуктов с высокой добавленной стоимостью; технологии исп-я хим. процессов биологического материала для получения различных хим. компонент.

Перспективными технолог. в хим. пром. явл.: 1) Биополимеры – полимеры явл. самым распростран. в мире материалом для производства упаковки, активно исп-я в строительстве, электро-технической и автомобильной отраслях. Всё больше внимания в мире уделяют приданию биодеградируемых св-в пластикам, путём введения модифицирующих добавок и в 1ю очередь биполимеров. 2) Переработка сырья, содержащего лигноцеллюлозу. Переработка такой биомассы и получ. с помощью гидролиза первичных материалов для хим. пром. – этилового спирта, фурфурола, левулиновой к-ты. 3) Создание биокатализатора для интенсификации пром. процессов. В мире большое внимание уделяется созданию ферментов, применение которых позволяет создать первичные хим. компоненты биотехнологическими методами, что значительно сокращает энергопотребление и снижает уровень выбросов.

4. Биотехнологии

Биотехнологии в добывающей пром. – технологии исп-я микроог-ов для повышения результативности в горно- и нефтедобывающей пром., снижение уровня опасности в угольных шахтах. Перспективными направлениями для биотехнологических разработок в добывающей пром. явл. создание бактериальных штаммов, способных эффективно: 1) повышать нефтеотдачу за счёт повышения вязкости вводимых в пласт р-ров (полисахариды); 2) увеличивать выход благородных цвет. металлов за счёт выщелачивания мин.; 3) снижать конц. метана в атмосфере угольных шахт.

«Зелёная» биотехнология

1. Агробиотехнологии

С/х биотехнологии – технологии исп-я научных методов, включая ряд методов ген. инженерии для созд., улучшения и изменения св-в живых организмов, раст., животных и микроорг-ов. Применение биотехнологий в с/х нацелено на стабилизацию с/х производства, решение проблемы продовольственной безопасности, получение продуктов питания улучшенного кач-ва и экологич. чистоты.

Перспективными технолог. в отрасли явл. технологии ген. инженерии: молекулярное клонирование – метод получения ДНК-генов в больших кол-вах; секренирование – набор методов определения последовательности нуклеотидов. Благодаря исп-ю этих методов и технологий можно создавать раст. и животных с заранее выбранными признаками и св-вами, что делает их устойчивыми к вредителям и болезням. Дальнейшее развитие биотехнологии будет двигаться в направлении объединения различных полезных качеств в 1 организме.

Главная цель биотехнологий в с/х – повышение урожайности.

Широкое исп-е технологий в с/х России позволит решать след. проблемы и добиваться след. результатов: 1) увел. производительности водоросли, увел. урожайности, в т. ч. появл. устойчивости раст. к вредителям; 2) устойчивость к вирусным, грибковым и бактериальным болезням, улучш. кач-венных характеристик; 3) уменьшение исп-я пестицидов и гербицидов; 4) сокращение выбросов СО₂; 5) сохранение и увел. разнообразия; 6) предотвращение эрозии почв за счёт перехода на метод обработки почв, не требующий вспахивания.

Хозяйства, которые намерены начать исп-ать биотехнологии в своём производстве, могут ожидать экономического эффекта в виде повышения эффективности исп-я с/х угодий и экономии на затратах.

2. Лесная биотехнология

Биотехнологии в лесном хозяйстве – технологии, позволяющие повысить эффективность лесной пром. благодаря ускоренному выращ. деревьев не подверженных вирусным и бактериальным заболеваниям, а также расш. естественных границ выращивания отдельных видов и сортов деревьев.

Ежегодный необходимый объём лесовосстановления в России составляет около 1 млн га. Для повышения интенсивности воспроизводства лесных массивов могут исп-ать след. технологии: 1) микроклональное размнож. – позволяет клонировать абсолютно здоровые раст., устойчивые к болезням и высаживать ген. идентичные экземпляры деревьев в пром. масштабе; 2) молекулярное маркирование – применяется для интенсификации селекционных работ, проведение паспортизации селекционных достижений, сертификации продукции лесной отрасли; 3) генная модификация – позволяет повысить скорость роста деревьев, для некоторых пород срок сокращается в 2-3 р., вывести невосприимчивые к заболеваниям породы деревьев, увеличить содержание целлюлозы в древесине, что в совокупности повышает хоз. ценность лесов и эффективность лесных комплексов.