Генотипирование РНК CIMM-HCV

РНК из супернатантов клеточных культур амплифицировали с помощью вложенной ОТ-ПЦР с использованием набора праймеров для анализа ОТ-ПЦР с положительной цепью, как описано выше. Продукты ОТ-ПЦР клонировали в вектор клонирования ПЦР 4.1 (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA). Плазмидную ДНК выделяли из отдельных клонов и секвенировали на автоматическом секвенаторе ДНК ABI 377 с использованием набора для секвенирования красителя (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Очистка иммуноглобулина (IgG) из сывороток пациентов, инфицированных ВГС

Сыворотку от пациента № 081 наносили на колонку с белком А Affi-Gel II (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) и элюировали фракцию IgG. Очищенный IgG концентрировали на колонках Microcon 50 (Millipore Corp., Billerica, MA) и хранили при -20 ° C.

Экстракция вирусных белков из супернатантов клеточных культур

Общие белки осаждали из 1 мл супернатанта клеточной культуры или сыворотки пациента с помощью TRI REAGENT (Molecular Research Center, Inc. Cincinnati, OH). Промытый этанолом осадок белка растворяли в 200–500 мкл 1% SDS путем инкубации при 55 ° C в течение 10 минут. Любые оставшиеся нерастворимые субклеточные частицы удаляли центрифугированием при 14000 × g в течение 10 минут при 4 ° C. Белки количественно определяли с использованием анализа белка Брэдфорда (Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO) и замораживали (-20 ° C).

Дот-блот и Вестерн-блот анализ

Для анализа методом дот-блоттинга 2 мкл различных образцов белка (неразбавленных до 10 ^-3) разбавляли до 25 мкл, используя TBS, и подвергали дот-блоттингу на нитроцеллюлозную мембрану (0,22 мкл, Micron Separations Inc. Westboro, MA). Для вестерн-анализа белки разделяли с помощью SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Bio-Rad Labs). Мембраны блокировали 2% обезжиренного молока в 20 мМ TBS, 500 мМ NaCl, 0,02% Твин 20 в течение 1 часа. Затем образцы инкубировали с очищенным IgG (разведение 1: 1000) в течение 2–4 часов при комнатной температуре. Связывание антител определяли путем инкубации с козьими анти-человеческими антителами, конъюгированными с щелочной фосфатазой, с последующим развитием окраски (Bio-Rad) [ 15 ].

Номера доступа последовательностей HCV, используемых для генотипирования

5'-последовательность UTR была получена с использованием праймеров 10.1 и 10.2 (таблица 1) и имеет регистрационный номер DQ010313. Частичная последовательность области NS5B была получена с использованием C-анти и обратного комплемента праймеров C1A и имеет регистрационный номер DQ010314.

Результаты

Девять лет назад мы взяли на себя обязательство изолировать инфекционный HCV от пациентов и выращивать такие изоляты in vitro. Наши первоначальные эксперименты по разработке системы репликации HCV in vitro были выполнены, как ранее сообщалось многими исследователями, с использованием большого разнообразия установленных клеточных линий, состоящих из различных типов клеток [ 16 ]. Они включали трансформированные клетки печени человека в дополнение к Hela, CEM, H9, Jurkat, Molt 3, Molt 4, U937, P3HR1, Raji, Daudi, фибробластам крайней плоти человека (ATCC, Bethesda, MD). Все эти типы клеток могут быть инфицированы описанными методами, за исключением фибробластов крайней плоти человека, которые не поддаются лечению (таблица 2).). Результаты этих усилий не оказались воспроизводимыми для устойчивой репликации ВГС. Хотя мы смогли обнаружить положительную и отрицательную (репликативную) РНК для ВГС в нескольких В-клетках, клетках печени и моноцитоидных клетках, ни одна из этих стандартных клеточных линий не продуцировала инфекционный ВГС, который мог передаваться в неинфицированные клетки. Эти недавно инфицированные клеточные культуры в конечном итоге стали отрицательными для РНК HCV, в то время как неинфицированные клетки росли. Теперь мы знаем из нашего опыта, что HCV ведет себя как литический вирус, с гибелью клеток в инфицированных культивируемых клетках до 20%. Инфицированные B-клетки образуют увеличенные клетки, которые в конечном итоге погибают без дальнейшей репликации (Fig. 2C).). Клеточная линия U937, несмотря на ее моноцитарную природу и наличие детектируемой РНК ВГС с положительной и отрицательной цепью, имела очень низкие уровни экспрессии вирусной РНК.

Таблица 2 Краткое изложение экспериментов по передаче ВГС с различными гематопоэтическими клетками и клетками печени

Таблица в натуральную величину

Фигура 2

In vitro размножение HCV в культивируемых клетках. Морфология клеток-предшественников нейронов, инфицированных ВГС. (A) T (конечный мозг, суспензионные клетки, которые растут в скоплениях, а также могут прилипать к пластике), и (B) M (metencephalon, прежде всего прикрепленные клетки, которые развивают нейрональные процессы). (C) Недавно трансформированные B-клетки совместно культивируют с макрофагами, инфицированными HCV. Ни одна из этих клеток не имеет выраженных цитопатических эффектов по сравнению с неинфицированными клетками.