Передача вируса гепатита С от пациентов во вторичные клетки для длительного культивирования

Передача вируса гепатита С от пациентов во вторичные клетки для длительного культивирования

• Деннис Реви,
• Рави С Брайч,
• Дэвид Бэйлс,
• Николай Челяпов,
• Рафат Хан,
• Шерил Гир,
• Ричард Рейсман,
• Энн С Келли,
• Джон Г Причард &
• С Заки Салахуддин

Вирусологический журнал, том 2, номер статьи: 37 (2005) | Скачать цитату

Метрика статьи

· 15k доступов

· 17 Цитат

Абстрактные

Заражение вирусом гепатита С человека (ВГС) является основной причиной посттрансфузионного гепатита и хронических заболеваний печени во всем мире. Надежная система культивирования in vitro для выделения и анализа этого вируса в настоящее время недоступна, и, как следствие, патогенез ВГС плохо изучен. Здесь мы сообщаем о первой надежной системе in vitro для выделения и размножения ВГС из зараженной донорской крови. Эта система включает заражение свежеприготовленных макрофагов вирусом гепатита С, а затем передачу адаптированного к макрофагам вируса в недавно иммортализованные В-клетки из пуповинной крови человека. Используя эту систему, недавно выделенный ВГС был воспроизведен in vitro. в непрерывных культурах более 130 недель. Эти изоляты также были переданы бесклеточными методами в клетки различных типов, включая В-клетки, Т-клетки и клетки-предшественники нейронов. Эти вторично инфицированные клетки также продуцируют трансмиссивный инфекционный вирус in vitro. Репликация РНК HCV была подтверждена с помощью анализа ОТ-ПЦР и гибридизации in situ. Хотя секвенирование нуклеиновой кислоты в изоляте HCV, о котором здесь сообщается, указывает на то, что изолят, вероятно, относится к типу 1a, другие типы HCV также были выделены с использованием этой системы. Вестерн-блот анализ показывает синтез основных структурных белков HCV. Мы представляем здесь впервые метод продуктивного выращивания ВГС in vitro. на длительные периоды времени. Этот метод позволяет проводить исследования, связанные с пониманием процесса репликации, вирусного патогенеза и разработкой лекарств и вакцин против HCV.

Введение

Глобальное воздействие хронического гепатита С и последующего заболевания печени на общественное здоровье продолжает расти. Было подсчитано, что в мире насчитывается более 170 миллионов носителей ВГС, причем число новых инфекций возрастает [ 1 ]. В Соединенных Штатах, по оценкам, от 1% до 5% из 2,7 миллионов человек, которые в настоящее время хронически инфицированы, умрут от инфекции ВГС [ 2 ].

Хотя оказалось, что HCV очень трудно выращивать in vitro, РНК HCV была обнаружена в клеточных культурах различных типов клеток, присутствие РНК HCV с положительной цепью сохраняется в течение периодов от нескольких дней до нескольких месяцев, хотя и без признаков инфекционного вируса [ 3 - 6 ]. Недавнее создание HCV-РНК репликонах способствовало лучшему пониманию некоторых молекулярных событий, в частности генной экспрессии [ 7 - 9 ]. Однако исследования с использованием частей вируса могут дать лишь ограниченную информацию об инфекционном процессе и патогенезе определенного генотипа. Для разработки эффективных рациональных методов лечения и производства защитных вакцин, воспроизводимых in vitro Система для выделения и репликации HCV от пациентов имеет решающее значение.

Мы сообщаем здесь, что выделение и длительная репликация HCV in vitro. Поскольку это первый опыт активной репликации ВГС in vitro, некоторые результаты, показанные здесь, могут не соответствовать современным концепциям, использующим системы, которые не реплицируют инфекционный вирус.

Материалы и методы

Заражение культивируемых клеток сыворотками от пациентов, инфицированных ВГС

Инфицированная HCV сыворотка пациента (минимум 10 ⁴ эквивалентов генома / мл) была отфильтрована через фильтры 0,45 мкм (Fisher Scientific) и заморожена в аликвотах по 1 мл при -70 ° C. Свежий флакон с замороженной сывороткой использовали для каждого нового эксперимента по передаче. Клетки инфицировали, используя 500 мкл талой донорской сыворотки [ 10, 11 ].

Генерация макрофагов

Макрофаги генерировали из мононуклеарных клеток пуповинной крови человека (CBMCs) путем обработки форбол-12-миристат-13-ацетатом (PMA, 5 нг / мл в полной среде) [ 12]. Большинство клеток, прилипших к пластику, были положительными на неспецифическую эстеразу и фагоцитоз, которые являются установленными маркерами для всех макрофагов. Во всех случаях были приготовлены несколько колб (Falcon 3108 и 3109) для отдельного использования либо для заражения сыворотками HCV, либо для совместного культивирования с мононуклеарными клетками периферической крови инфицированного пациента (РВМС). Неадгезивные клетки содержали приблизительно 60% CD19 и CD20-позитивных B-клеток, причем остальную часть составляли T-клетки и моноциты. Клетки, которые не окрашивались в отношении макрофаг-специфических маркеров или фагоцитоза, были обозначены как недеформированные лимфоидные клетки, а затем инфицированы либо HCV с использованием 500 мкл сыворотки, либо совместно культивированы с PBMC от того же пациента.

Заражение макрофагов ВГС

Макрофаги сначала обрабатывали полибреном (5 нг / мл) в течение ночи, а затем инфицировали либо 500 мкл сывороток, либо совместно культивировали с РВМС от того же пациента (фиг. 1А). Эти инфицированные макрофаги инкубировали в течение ночи при 37 ° С в атмосфере с 5% СО ₂. Среды были изменены, и культуры были продолжены в течение еще шести дней со сменой среды на четвертый день.

Фигура 1

Выделение ВГС от людей. (A) Схема выделения для репликации HCV in vitro. (Б) История передачи образца, пожертвованного от инфицированного ВГС пациента № 081. Свежие макрофаги инфицировали с использованием бесклеточной сыворотки или совместно культивировали с инфицированным HCV PBMC из крови пациента # 081. Т-клетки человека (112 А), В-клетки (112 В) или неосвоенные лимфоидные клетки (112 АБ) затем были инфицированы бесклеточной передачей ВГС из супернатанта клеточной культуры из макрофагов или совместно культивированы с макрофагами, инфицированными ВГС., Точно так же недавно трансформированные В-клетки пуповинной крови (PCLB 1 °) были инфицированы бесклеточной передачей из ранее инфицированного супернатанта культуры В-клеток (112 B). Неинфицированные трансформированные В-клетки (PCLB T1-T4) инфицировали последовательной бесклеточной передачей из отфильтрованного культурального супернатанта PCLB 1 °. Клетки-предшественники нейронов были инфицированы бесклеточной передачей HCV из отфильтрованного культурального супернатанта # 081.

Бесклеточная передача ВГС

Клетки-мишени предварительно обрабатывали в течение ночи полибреном (5 нг / мл). Аликвоту 500 мкл супернатанта клеточной культуры использовали для заражения каждой из клеток-мишеней.

Таблица 1 Праймеры, используемые для анализа ВГС

Таблица в натуральную величину

Результаты

Девять лет назад мы взяли на себя обязательство изолировать инфекционный HCV от пациентов и выращивать такие изоляты in vitro. Наши первоначальные эксперименты по разработке системы репликации HCV in vitro были выполнены, как ранее сообщалось многими исследователями, с использованием большого разнообразия установленных клеточных линий, состоящих из различных типов клеток [ 16 ]. Они включали трансформированные клетки печени человека в дополнение к Hela, CEM, H9, Jurkat, Molt 3, Molt 4, U937, P3HR1, Raji, Daudi, фибробластам крайней плоти человека (ATCC, Bethesda, MD). Все эти типы клеток могут быть инфицированы описанными методами, за исключением фибробластов крайней плоти человека, которые не поддаются лечению (таблица 2).). Результаты этих усилий не оказались воспроизводимыми для устойчивой репликации ВГС. Хотя мы смогли обнаружить положительную и отрицательную (репликативную) РНК для ВГС в нескольких В-клетках, клетках печени и моноцитоидных клетках, ни одна из этих стандартных клеточных линий не продуцировала инфекционный ВГС, который мог передаваться в неинфицированные клетки. Эти недавно инфицированные клеточные культуры в конечном итоге стали отрицательными для РНК HCV, в то время как неинфицированные клетки росли. Теперь мы знаем из нашего опыта, что HCV ведет себя как литический вирус, с гибелью клеток в инфицированных культивируемых клетках до 20%. Инфицированные B-клетки образуют увеличенные клетки, которые в конечном итоге погибают без дальнейшей репликации (Fig. 2C).). Клеточная линия U937, несмотря на ее моноцитарную природу и наличие детектируемой РНК ВГС с положительной и отрицательной цепью, имела очень низкие уровни экспрессии вирусной РНК.

Таблица 2 Краткое изложение экспериментов по передаче ВГС с различными гематопоэтическими клетками и клетками печени

Таблица в натуральную величину

Фигура 2

In vitro размножение HCV в культивируемых клетках. Морфология клеток-предшественников нейронов, инфицированных ВГС. (A) T (конечный мозг, суспензионные клетки, которые растут в скоплениях, а также могут прилипать к пластике), и (B) M (metencephalon, прежде всего прикрепленные клетки, которые развивают нейрональные процессы). (C) Недавно трансформированные B-клетки совместно культивируют с макрофагами, инфицированными HCV. Ни одна из этих клеток не имеет выраженных цитопатических эффектов по сравнению с неинфицированными клетками.

Передача изолятов ВГС

Чтобы показать, что наша система может использоваться для выращивания ВГС в течение продолжительных периодов времени, мы протестировали каждый изолят через регулярные интервалы с помощью ОТ-ПЦР и повторной передачи в свежие клетки (Таблица 3).). Из-за большого количества образцов, которые были протестированы, выделение ВГС и длительная репликация проводились в несколько этапов: краткосрочные культуры (положительные на ВГС до 10 недель), среднесрочные культуры (положительные в течение 10–23 недель) или культуры длительного срока (положительный результат более 23 недель). Эксперименты с использованием сывороток пациентов или PBMC в равной степени способны инфицировать макрофаги, которые могут быть использованы для бесклеточной передачи HCV. Мы не сравнивали уровни вируса, продуцируемого этими двумя методами. Примером долгосрочной положительной клеточной культуры является изолят № 081. Этот изолят был получен из аналогично пронумерованной сыворотки от донора № 081. Изолят № 081 поддерживается в культуре более ста тридцати недель. Это обозначается как изолят индекса: CIMM-HCV. Этот изолят был размножен в различных типах клеток, таких как обогащенные B-клетки, Т-клетки и неопределяемые лимфоидные клетки, полученные из свежей крови как с помощью совместного культивирования, так и бесклеточных методов. Последовательные передачи в недавно трансформированные В-клетки были выполнены бесклеточными методами для дальнейшего анализа (рисунок1б). Первый перенос HCV из макрофагов в клетки-мишени обозначен как T1. Перенос из культуры T1 в свежие клетки-мишени обозначен как T2. Перенос изолятов проводился целых четыре раза (Т4), таких как изолят PCLBT4. Супернатанты клеточных культур собирали, по меньшей мере, каждый месяц и анализировали на наличие РНК HCV с положительной цепью с помощью вложенного анализа ОТ-ПЦР (таблица 3). Вложенная ПЦР была использована в качестве диагностического метода многими исследователями [ 18 - 20 ] и использовалась для устранения ложноположительных результатов. Из-за стабильно положительных вложенных анализов ПЦР и последовательной биологической передачи в течение многих месяцев изолированный HCV считался реплицирующим и инфекционным вирусом.

Таблица 3 История позитивности ВГС для изолятов CIMM-HCV ¹

Таблица в натуральную величину

Наши результаты показывают, что нет существенной разницы между использованием сыворотки пациента или РВМС в качестве источника инфекционного агента, но не было предпринято попыток количественного определения уровней инфекционного вируса в первичных образцах (сыворотке или клетках). Поскольку для передачи вируса может быть достаточно только одной клетки, продуцирующей инфекционный вирус, оба метода могут быть использованы для успешного культивирования ВГС.

Целый ряд изолятов ВГС

CIMM-HCV поддерживается в одном типе клеток: недавно трансформированные B-клетки. Чтобы установить диапазон хозяев этого изолята, большое количество типов клеток было протестировано на размножение HCV, как описано ранее. Помимо В-клеток и макрофагов, нейрональные предшественники также могут быть инфицированы. Эти нейрональные клетки очень похожи на макрофаги, и они стали значительным продуцентом инфекционного ВГС (Таблица 4). Нейронные Т-клетки растут в больших неприлипающих и прилипающих скоплениях, а М-клетки, как правило, прилипают и образуют нейрональные клеточные процессы. Они выжили от инфекции ВГС лучше, чем В-клетки с точки зрения жизнеспособности клеток (рис. 2А и 2В). Бесклеточный CIMM-HCV был передан нашим двум типам нейрональных клеток, T (конечный мозг) и M (средний мозг), которые впоследствии показали репликацию трансмиссивного инфекционного вируса (эксперимент 244). Вирус из этих клеток впоследствии передавался свежим культурам нейронов Т и М в эксперименте 248 и 248–260 (таблица 4). Эти повторные передачи были аналогичны выполненным для В-клеток (таблица 3). Инфекции нейрональных клеток повторяли несколько раз с аналогичными результатами в отношении продукции HCV. С тех пор мы передавали этот HCV из экспериментов с 260 по 273 и с 273 по 277 (данные не показаны).

Таблица 4 Передача HCV человека в нейрональные клетки-предшественники ¹

Таблица в натуральную величину

Рисунок 3

Обнаружение РНК HCV с положительной и отрицательной цепью в культурах инфицированных клеток с помощью ОТ-ПЦР. Положительные нити анализировали с использованием супернатанта клеточной культуры, тогда как отрицательные нити анализировали с использованием общей РНК, очищенной от клеток. (A) Определение оптимального дня для сбора HCV для выделения и анализа РНК. Приблизительно один миллион клеток культуры № 081 делили на семь колб и инкубировали. В каждый последующий день собирали одну колбу и анализировали на РНК с положительной и отрицательной цепью. (B) Количественное определение молекул РНК HCV с положительной цепью на мл супернатанта клеточной культуры с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. (C РНК HCV с положительной и отрицательной цепью в разных клетках, инфицированных CIMM-HCV. Полоса 1 CIMM-HCV, полоса 2 Т-клетки (112 А), полоса 3 В-клетки (112 В), полоса 4 без фиксации лимфоидных клеток (112 АБ), полоса 5 4- ^я последовательная передача в иммортализованный шнур В- клетки (PCLB T4), Т-клетки дорожки 6 (200 А), В-клетки дорожки 7 (200 В), неинфицированные В-клетки дорожки 8, сыворотка пациента, инфицированная HCV на дорожке 9, и отрицательный контроль ПЦР на дорожке 10.

Рисунок 4

Обнаружение РНК HCV в культивируемых клетках путем гибридизации in situ с зондами S ³⁵ -меченной РНК и детектирование белка HCV с помощью флуоресцентной микроскопии. (A, B) Зараженные B-клетки, гибридизованные с меченым РНК-зондом с положительной цепью. (C) Свеже трансформированные неинфицированные B-клетки, не проявляющие значительной гибридизации. (D) Изображение недавно трансформированных неинфицированных B-клеток, не демонстрирующих значительной гибридизации и имеющих более широкое поле зрения, чем (C). (E) Зараженные В-клетки, гибридизованные с меченым РНК-зондом с отрицательной цепью. (F Инфицированные HCV клетки: PCLBT4, обработанный человеческим поликлональным IgG, очищенным из сыворотки пациента 081 и окрашенным козьим анти-человеческим IgG, конъюгированным с изотиоцианатом флуоресцеина (FITC). PCLBT4 является четвертым последовательным переносом HCV недавно иммортализованным B-клеткам.

Рисунок 5

Точечный анализ связывания белков HCV с IgG из сывороток пациентов. Белки HCV были получены из жидкости для тканевых культур. Белковые препараты серийно разбавляли (1, 10 ^-1, 10 ^-2, 10 ^-3) и дот-блоттинг наносили на нитроцеллюлозную мембрану. Эти пятна затем обрабатывали антителами пациентов. На рисунке показаны (A) Реакции IgG пациента против разведений сывороток пациентов, истощенных по IgG, супернатантов клеточной культуры CIMM-ВИЧ из различных клеточных линий (В-клетки, инфицированные HCV, HCV-инфицированные клетки-предшественники нейронов T и M человека) или коммерческие антигены (NS4 и Core-антиген) или неинфицированные B-клетки. (B) Реакции IgG пациента против разведений различных изолятов HCV, выращенных in vitro. как описано ранее. Все изоляты HCV были от первого переноса на свежие В-клетки (T1), за исключением изолятов 314T2 (второй перенос) и PCLBT4 (четвертый перенос). Эти инфицированные клетки находились в культуре в течение различных периодов времени, включая более трех лет для PCLBT4.

Анализ белков ВГС

Геном HCV кодирует полипротеин, который впоследствии перерабатывается в ряд зрелых структурных и неструктурных фрагментов [ 34 ]. Чтобы определить, продуцирует ли CIMM-HCV репликация основные белки HCV, проводили Вестерн-блот анализ с использованием невосстанавливающих условий. Поликлональный IgG обнаружил серию белков (i) в сыворотках пациентов, инфицированных вирусом гепатита С, и (ii) в супернатанте культуры инфицированных клеток (фиг. 6А и 6В). В этих образцах были обнаружены белки 140, 75, 50, 37, 32, 27 и 25 кДа. Поликлональный IgG также дал положительную реакцию с коммерчески полученным рекомбинантным основным антигеном (дорожка 5, фиг. 6А).). Этот основной антиген имеет β-галактозидазу, слитую с N-концом, и, таким образом, имеет размер приблизительно 140 кДа, как сообщает производитель.

Рисунок 6

Вестерн-блот анализ белков HCV в невосстанавливающих условиях. Белки выделяли из супернатантов клеточных культур. (A) Анализ белков с большой молекулярной массой из супернатантов клеточной культуры CIMM-HCV в различных клеточных линиях. Неинфицированные трансформированные В-клетки на линии 1, трансформированные В-клетки на линии 2, инфицированные HCV, нейрональные клетки-предшественники 3-й линии, полученные из metencephalon, инфицированные HCV, общий белок 4-й линии из сыворотки, положительной для HCV, и коммерчески сконструированный антиген ядра HCV на 5-й линии (ViroGen), Другие меньшие полосы в основном антигене могут быть вызваны продуктами распада или другими загрязняющими белками. (В) Анализ низкомолекулярных белков CIMM-HCV, культивируемых в различных клеточных линиях. Общий белок 1-й линии из сыворотки, положительной по ВГС, В-клетки, трансформированные по 2-й полосе, инфицированные ВГС, нейрональные клетки-предшественники 3-й линии, полученные из метенцефалона, инфицированного ВГС, и неинфицированные трансформированные В-клетки из 4-й полосы.

Обсуждение

Наша система клеточных культур включает свежеприготовленные макрофаги и иммортализованные В-клетки для выделения ВГС. Выделения проводят с использованием как совместных культур, так и бесклеточных методов. Свежеприготовленные макрофаги в нашей системе необходимы в качестве промежуточного хозяина для выделения ВГС. Мы не исследовали механизм заражения или репликации HCV, но макрофаги из различных источников, по-видимому, играют положительную роль в этом процессе. Возможно, что макрофаги либо концентрируют частицы ВГС, либо модифицируют ВГС в достаточной степени, чтобы позволить им инфицировать другие типы клеток. Например, изменения в гликозилированных белках оболочки E1 и E2 [ 36, 38, 39] может влиять на инфекционную способность вируса потомства, а также определять диапазон его хозяев. У бактерий, заражающих фаг, их ДНК может быть модифицирована системой модификации хозяина. Это позволяет фагу избежать системы ограничения, тем самым способствуя лучшему заражению новых хозяев. Поэтому нетрудно представить, что различные типы клеток животных могут производить модифицированные версии заражающих вирусов. Эти вирусы могут преимущественно инфицировать клетки разных типов. Также возможно, что макрофаги уменьшают или устраняют дефектные ВГС, обнаруженные в крови пациента, что может помешать запуску продуктивной системы культивирования. Таким образом, макрофаги будут действовать как привратник, позволяя культивировать только интактный ВГС и не допускать дефектных, которые могут помешать культивированию.

Как указывалось ранее, мы обнаружили, что клетки-предшественники нейронов могут быть инфицированы CIMM-HCV и, в свою очередь, являются значительными продуцентами инфекционного вируса. Мы неоднократно передавали несколько изолятов HCV в эти нейрональные клетки. Эти клетки похожи на другие макрофаги как по характеристикам окрашивания, так и по функциональным анализам. Они зависят от факторов роста и хорошо растут в пробирке и был в культуре более двух лет. Макрофаги из других источников, например, клетки Купфера из печени, заражаются, но через несколько недель постепенно теряют выработку вируса. РНК ВГС, однако, может быть обнаружена в течение нескольких недель. Эта потеря продукции вируса может быть связана с созреванием, цитостазом и возможной гибелью клеток Купфера. Подобные эксперименты были выполнены с недавно культивированными эндотелиальными клетками, полученными из пуповины человека, потому что они связаны с гепатоцитами из печени, которые также являются эндотелиальными клетками. Результаты, полученные на этих клетках, также показали характер производства вируса, сходный с клетками Купфера.

Почти для всех вирусов человека наблюдается хорошо наблюдаемое явление асинхронности экспрессии, за редкими исключениями, такими как ВИЧ. Для вирусов герпеса человека, независимо от того, какую клетку-хозяина они используют, только меньшая часть клеток продуцирует реплицирующиеся вирусы [ 50, 51 ]. Мы не знаем, почему менее 5% клеток в нашей системе являются продуктивными. Вирусы иммунодефицита человека, такие как ВИЧ-1, демонстрируют активную репликацию менее чем у 20% инфицированных Т-клеток при использовании свежеизолированных лейкоцитов [ 52 ]. В описанной нами системе используются все свежеизолированные клетки. Весьма вероятно, что конкретный рецептор может быть ограничивающим фактором при определении количества заражаемых клеток.

Мы определили, что количество HCV-РНК в супернатанте клеточной культуры возрастает до 5 дня, а затем постепенно снижается. Следовательно, пятый день после пересева является оптимальным для сбора HCV-RNA. Как показано на рисунке 3C, сбор РНК в день 5 позволяет воспроизводимое обнаружение РНК HCV. Изменения общих уровней HCV-RNA могут отражать сумму продукции РНК и разрушения РНК в культуре. Таким образом, наблюдаемая периодичность в положительной цепи может быть обусловлена: (1) замедлением процесса репликации инфицированных клеток или производством ингибитора in situ; или (2) лизис инфицированных клеток, вызывающий разрушение вируса и его РНК, например, с помощью высвобожденных протеаз и рибонуклеаз, или (3) обе из вышеупомянутых возможностей. Измеренный уровень отрицательной цепи в клетках оставался стабильным. Поскольку количество клеток и процент инфицированных клеток не изменяются во время культивирования вируса, наблюдаемая стабильность отрицательной цепи внутри клеток понятна.

Хотя большинство описанных выше образцов пациентов относятся к типу 1b, наш анализ последовательностей CIMM-HCV показывает, что это тип 1a. В области 5'UTR очень мало различий в последовательности между типами 1a и 1b. Изменение одной базы может привести к тому, что последовательность будет более похожа на тип 1b. Вполне возможно, что только небольшая часть ВГС у пациента действительно заразна, и поэтому наша система лучше всего определила его как тип 1а. Полная последовательность генома CIMM-HCV покажет его идентичность. Возможно, что у хронической инфекции у пациентов могут развиться мутанты, которые напоминают другой тип. Тем не менее, у нас есть дополнительные изоляты, которые согласуются с другими генотипами, такими как 1b (данные не показаны). Последовательности, о которых мы здесь сообщаем, указывают на то, что оба конца вирусного генома присутствуют в наших культурах.

Поскольку это первая система для культивирования ВГС in vitro, мы смогли сделать начальные наблюдения относительно репликации вируса. Дальнейшие исследования, связанные с репликацией и патогенезом ВГС, продолжаются. В точке результатов гибридизации показан на рисунке 4 показывает, что положительная цепь HCV синтезировала на уровне или мигрирует к плазматической мембране, и что с отрицательной цепью остается в цитоплазме. Это наблюдение может быть сделано только в динамической системе с активно реплицирующимся вирусом. Это предположение подтверждается недавними сообщениями о том, что РНК-зависимая РНК-полимераза содержит трансмембранный сегмент, который закреплен в мембране [ 53]. Также были обнаружены неструктурные белки и РНК положительной цепи, связанные с плазматическими мембранами [ 54 ]. Эти результаты предполагают, что сайт, где HCV полностью собран, вероятно, находится в плазменной мембране инфицированных клеток или рядом с ней. Вероятно, РНК HCV синтезируется в цитоплазме и мигрирует к плазматической мембране для окончательной сборки. Законченный вирион затем выпускается во внеклеточное пространство.

Мы считаем, что хронически инфицированный пациент вырабатывает антитела к своему собственному вирусу. Следовательно, поликлональный IgG специфичен для этого вируса. Это подтверждается нашим дот-блот-анализом нескольких разных изолятов HCV. Поскольку эти изоляты подверглись четырем отдельным переносам в свежие клетки и множеству последовательных пассажей, система, которую мы здесь описываем, поддерживает стабильные изоляты в культуре, продуцируя специфический для HCV белок.

Аналогичным образом, данные вестерн-блот-анализа белков HCV в супернатантах клеточных культур показывают, что присутствуют все ожидаемые основные структурные белки. Никаких специфических связываний антител не было обнаружено в образцах из неинфицированных супернатантов клеточных культур. Взятые вместе, эти результаты позволяют предположить, что в культурах клеток, инфицированных CIMM-HCV, имеется продукция специфических белков HCV. Эти данные показывают, что вирус, который был выращен в культуре, содержит эпитопы всех основных структурных белков, которые реагируют с антителами, очищенными от пациента. Это убедительное доказательство того, что вирус, выращенный в культуре, существенно не отличается от вируса гепатита С, растущего у пациента. Кроме того, один изолят, который был культивирован в нескольких различных клеточных линиях, показал постоянную структуру полос на вестерн-блотах. Это дополнительное и убедительное доказательство того, что полосы происходят от белков HCV. Мы пришли к выводу, что реплицирующийся вирус гепатита С является стабильным вирусом.

В дополнение к молекулярному анализу, который устанавливает, что наши клетки продуцируют вирионы ВГС, последовательная передача ВГС свежим неинфицированным клеткам через бесклеточные супернатанты культур устанавливает биологические доказательства наличия инфекционного вируса (Рис. 1B: PCLBT1-PCLBT4). Поскольку этот вирус является заразным в пробирке и все основные белки, по-видимому, присутствуют, вирус, который был выращен в культуре, скорее всего, содержит весь геном. Мы не считаем, что в нашей системе присутствует большое количество дефектных ВГС. Хотя наш стандартный анализ заключается в амплификации 5'-области UTR, мы смогли получить последовательности из других областей генома. Это, в сочетании с доказательствами присутствия основных структурных белков HCV, является убедительным доказательством присутствия всего генома. Кроме того, мы смогли использовать праймер HutLA2 (Таблица 1).), которая комплементарна области около 3 'конца положительной цепи, для получения кДНК. Используя наши стандартные праймеры из 5'-области UTR для амплификации кДНК, мы смогли обнаружить РНК с позитивной цепью HCV (данные не показаны). Это говорит о том, что значительная часть присутствующей РНК содержит как 3 ', так и 5' концы генома. Кроме того, в процессе работы предполагается, что в этой системе растет репрезентативная вирусная популяция, что говорит о том, что определенный генотип не выбран (Revie, Alberti и Salahuddin, рукопись в процессе подготовки).

Наша система позволила нам воспроизводимо изолировать ВГС от большинства пациентов, и в некоторых случаях эти клеточные культуры переносились более 130 недель. Наша способность выявлять ВГС в течение этих длительных периодов времени показывает, что мы не просто обнаруживаем вирус, который был разведен из исходного образца. Для начальной инфекции 50 мкл сыворотки добавляли к 2 мл среды, а затем среду меняли один раз в неделю в течение нескольких месяцев. Консервативная оценка разведения вируса через 130 недель будет более чем в 10 ¹³⁰ раз. Количество ВГС, продуцируемого из этой системы, было достаточным для проведения биологических, молекулярных и иммунологических исследований. Мы продолжаем проводить другие исследования в этой области.

Аналогия между макрофагальным распространением ВИЧ и ВГС in vitro довольно примечательна. Неинтегрины, захватывающие ICAM, специфичные для дендритных клеток (DC-SIGN), могут связывать ВИЧ и защищать его в течение длительных периодов времени, концентрируя и доставляя вирионы, вызывая инфицирование Т-клеток в транс с высокой эффективностью [ 55, 56 ]. Структурная основа для селективного распознавания олигосахаридов на белках оболочки вириона с помощью DC-SIGN и DC-SIGR действительно может быть общей моделью, посредством которой ВИЧ и HCV концентрируются для передачи in vitro их соответствующим чувствительным клеткам [ 57, 58]. В отличие от CD4 для ВИЧ, CD81-рецептор HCV в настоящее время является предметом серьезных дискуссий [ 58 - 61 ].

Мы хотели бы отметить, что наша система позволяет нам производить значительные количества ВГС, что сделало эти исследования возможными. Наличие надежной и долгосрочной системы роста HCV в клеточной культуре будет способствовать исследованиям in vitro, а также поможет в производстве рациональных лекарств и вакцин. Таким образом, эта система культивирования позволит исследователям в области ВГС и заболеваний печени провести широкий спектр дальнейших анализов, которые могут помочь в понимании жизненного цикла ВГС и механизмов патологий, индуцируемых у людей-хозяев.

Рекомендации

1. 1.

Всемирная организация здравоохранения: гепатит С: глобальная распространенность. Weekly Epidemiol Rec 1997, 72: 341-344.

o Google ученый

1. 2.

Salomon JA, Weinstein MC, Hammitt JK, Goldie SJ: Экономическая эффективность лечения хронического гепатита С в развивающейся популяции пациентов. JAMA 2003, 290: 228-237.

o Статья

o PubMed

o Google ученый

1. 3.

Iacovacci S, Sargiacomo M, Parolini I, Ponzetto A, Peschle C, Carloni G. Репликация и размножение генома вируса гепатита C в клетках печени плода человека. Res Virol 1993, 144: 275-279.

o CAS

o Статья

o PubMed

o Google ученый

1. 4.

Morsica G, Tambussi G, Sitia G, Novati R, Lazzarin A, Lopalco L, Mukenge S: Репликация вируса гепатита C в B-лимфоцитах (CD19 +). Blood 1999, 94: 1138-1139.

o CAS

o PubMed

o Google ученый

1. 5.

Симидзу Ю.К., Ивамото А., Хиджиката М., Перселл Р.Х., Ёсикура Н.: доказательства репликации in vitro генома вируса гепатита С в линии Т-клеток человека. Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 5477-5481.

o ПабМед Централ

o CAS

o Статья

o PubMed

o Google ученый

1. 6.

Sung V, Shimodaira S, Doughty A, Picchio G, Can H, Yen T, Линдсей K, Левин A, Lai M: Создание клеток В-клеточной лимфомы Линии, постоянно инфицированные вирусом гепатита С in vivo и in vitro: апоптотический эффект вирусной инфекции. J Virol 2003, 77: 2134-2146.

o ПабМед Централ

o CAS

o Статья

o PubMed

o Google ученый

1. 7.

Блайт К.Ю., Колыхалов А.А., Райс С.М.: Эффективная инициация репликации РНК ВГС в клеточной культуре. Science 2000, 290: 1972-1974.

o CAS

o Статья

o PubMed

o Google ученый

1. 8.

Ikeda M, Yi M, Li M, Lemon SM: Селектируемые дицистронные РНК субгеномного и геномного размера, полученные из инфекционного молекулярного клона штамма вируса гепатита C HCV-N, эффективно реплицируются в культивируемых клетках Huh7. J Virol 2002, 76: 2997-3006.

o ПабМед Централ

o CAS

o Статья

o PubMed

o Google ученый

1. 9.

Ломанн В., Корнер Ф., Кох Дж., Хериан У., Тейлманн Л., Бартеншлагер Р. Репликация субгеномных РНК вируса гепатита С в клеточной линии гепатомы. Science 1999, 285: 110-113.

o CAS

o Статья

o PubMed

o Google ученый

1. 10.

Аблаши Д.В., Луссо П., Хунг С.Л., Салахуддин С.З., Джозефс С.Ф., Лиана Т., Крамарский Б., Биберфельд П., Маркхэм П.Д., Галло Р.К.: Использование гематопоэтических клеточных линий человека для размножения и характеристики HBLV (вируса герпеса человека-6). Int J Cancer 1988, 42: 787-791.

o CAS

o Статья

o PubMed

o Google ученый

1. 11.

Салахуддин С.З., Аблаши Д.В., Маркхэм П.Д., Джозефс С.Ф., Штурценеггер С., Каплан М., Халлиган Г., Биберфельд П., Вонг-Сталь Ф., Крамарский Б., Галло Р.К.: Выделение нового вируса HBLV у пациентов с лимфопролиферативными нарушениями. Science 1986, 234: 596-601.

o CAS

o Статья

o PubMed

o Google ученый

1. 12.

Салахуддин С.З., Накамура С., Биберфельд П., Каплан М.Х., Маркхэм П.Д., Ларссон Л., Галло Р.К.: Ангиогенные свойства клеток, полученных саркомой Капоши, после длительной культуры in vitro. Science 1988, 242: 430-433.

o CAS

o Статья

o PubMed

o Google ученый

1. 13.

Fingeroth JD, Weiss JJ, Tedder TF, Strominger JL, Biro PA, Fearon DT: Рецептор вируса Эпштейна-Барра В-лимфоцитов человека представляет собой C3d-рецептор CR2. Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 4510-4514.

o ПабМед Централ

o CAS

o Статья

o PubMed

o Google ученый

1. 14.

Луссо П., Аблаши Д.В., Лука Дж.: Взаимодействие HHV-6 и других вирусов. В Эпидемиологии Герпесвируса человека 6, Молекулярной биологии и Клинической Патологии. Том 4. Под редакцией: Аблаши Д.В., Крюгер Г.Р.Ф., Салахуддин С.З. Амстердам, Нидерланды: Elsevier; 1992: 121-133.

o Google ученый

1. 15.

Джозефс С.Ф., Салахуддин С.З., Аблаши Д.В., Шахлер Ф., Вонг-Стал Ф., Галло Р.К.: Геномный анализ B-лимфотропного вируса человека. Science 1986, 234: 601-603.

o CAS

o Статья

o PubMed

o Google ученый

1. 16.

Като Н., Симотохно К.: Системы культивирования вируса гепатита С. Curr Top Microbiol Immunol 2000, 242: 261-278.

o CAS

o PubMed

o Google ученый

1. 17.

Moriuchi H, Moriuchi M, Combadiere C, Murphy PM, Fauci AS: CD8 + Т-клеточный растворимый фактор (ы), но не бета-хемокины RANTES, MIP-1 альфа и MIP-1 бета, подавляют репликацию ВИЧ-1 в моноцитах / макрофагах. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93: 15341-15345.

o ПабМед Централ

o CAS

o Статья

o PubMed

o Google учен<