Суспензионное культивирование

Культуры клеток растений, выращиваемые в жидкой питательной среде, обычно называют суспензионными (глубинными) культурами. Существуют определенные проблемы получения культуры, состоящей преимущественно из отдельных клеток или небольших их агрегатов. Для решения этих проблем используют методы получения клеточной суспензии применительно к растительным клеткам.

Выращивание клеточных суспензий в жидкой питательной среде имеет ряд преимуществ перед выращиванием каллусных клеток поверхностным способом. Суспензионные культуры удобнее для проведения биохимических и молекулярно-биологических экспериментов - изучения индукции ферментов и связи их с событиями клеточного цикла, экспрессии и репрессии определенных генов, изолирования и характеристик мутантов.

Суспензионную культуру можно получить из фрагментов органа растения (диски паренхимы и др.), хотя этот путь более трудоемкий и требует большего времени. Клетки экспланта должны при этом образовывать первичный каллус, и только после этого поверхностные каллусные клетки, попавшие в жидкую среду и размножившиеся в ней, дадут начало линии, способной расти в суспензии. Обычно для получения культуры клеток используется культура каллусной ткани. Для получения культуры клеток берется наиболее жизнеспособная (пролиферирующая) часть каллусной ткани, а ее количество в расчете на единицу объема питательной среды должно быть в 15-20 раз больше, чем при серийном культивировании на агаре. При этом может использоваться питательная среда того же состава, что и для поверхностного культивирования.

Образование первичной суспензии растительных клеток может быть результатом трех процессов:

- распада каллусной ткани на клетки и небольшие клеточные агрегаты в момент внесения в жидкую питательную среду;

- отделения клеток и клеточных агрегатов с поверхности кусочков ткани в течение первых субкультивирований;

- деления и роста клеток и распада разрастающихся клеточных агрегатов на более мелкие агрегаты и клетки.

Первичную суспензию перед субкультивированием разделяют на фракции по скорости седиментации, используя специальный цилиндр (берут верхнюю фракцию), либо фильтруют через 1-2 слоя марли, нейлоновые или металлические сита, чтобы избавиться от крупных плотных кусков каллусной ткани, остатков экспланта и очень крупных агрегатов.

Для глубинного культивирования растительных клеток применяют методы, разработанные для микробиологических целей. Используют закрытые или открытые системы в периодическом или проточном режимах. Однако при глубинном выращивании растительных клеток принцип турбидостата практически не применяется. Одной из причин этого является разрушения части клеток при отводе их к оптическому прибору. Выращивание суспензии клеток растений в установках непрерывного культивирования по принципу хемостата применяется как для изучения метаболизма клеток, стабильно поддерживающихся в разных фазах клеточного цикла, так и при промышленном выращивании клеточной биомассы с целью получения экономически важных продуктов.

Наиболее изученным и распространенным режимом глубинного культивирования клеточных суспензий в настоящее время является закрытая периодическая система. В этом случае для аэрации и перемешивания суспензии используют роллеры, качалки (обычно круговые), ферментеры с механическими и магнитными мешалками или ферментеры барботажного типа, где аэрация и перемешивание осуществляется воздушным потоком. Критериями роста в цикле выращивания служит увеличение числа клеток, их сырой и сухой массы. Модельная ростовая кривая имеет типичную S-образную форму, на которой различают: I - лаг-фазу; II - экспоненциальную фазу; III - фазу линейного роста; IV -замедленного роста; V - стационарную фаза; VI - фазу отмирания (рис. 11).

 латентной фазе (лаг-фазе) видимого роста инокулята не наблюдается. При этом наблюдается высокая интенсивность дыхания, максимальные значения энергетического уровня, интенсивный синтез ДНК, РНК, белков и других компонентов клетки, но низкий митотический уровень. Длительность фазы зависит от количества и физиологического состояния инокулята и условий культивирования. Экспоненциальная фаза характеризуется максимальными скоростью роста и величинами митотической активности, а также преобладанием мелких клеток меристематического типа. На протяжении линейной фазы скорость роста постоянна. Фаза замедленного роста связана с субстратным лимитированием и ингибированием продуктами обмена. Для стационарной фазы характерна малая скорость деградации клеток, которая уравновешивается делением клеток. В фазе отмирания клеток удельная скорость роста принимает отрицательное значение.

Форма реальных ростовых кривых может значительно отличаться продолжительностью фаз от модельной. Процессы ростового цикла зависят от вида растения, количества внесенного материала и условий культивирования (состав питательной среды, температура, начальное значение рН, состав газовой фазы, скорость перемешивания). Первичный и вторичный метаболизм культивируемых клеток растений видоспецифичен, зависит от типа дифференцировки исходных клеток растения и регулируется условиями выращивания. Генетическая изменчивость клеток как следствие их культивирования вне организма приводит к возникновению из первичной каллусной ткани генетически и фенотипически различающихся линий клеток. Это позволяет отобрать или экспериментально создать линии, сохраняющие биосинтетические системы, характерные для исходного растения, и линии, синтезирующие принципиально новые вещества.