Особенности получения антибиотиков

Получение антибиотиков

В настоящее время для практических целей наибольший интерес представляет ферментативный синтез антибиотиков микроорганизмами. Получение антибиотиков из макроорганизмов пока является предметом научных исследований. Химический синтез антибиотиков в производственных масштабах осуществляется довольно редко (см. 4.1.6.3). 4.1.6.1. Биологический синтез Па заре развития антибиотической промышленности основным способом выращивания микроорганизмов были поверхностные культуры. Питательный раствор, содержавший необходимое количество углерода, азота и минеральных веществ, наливали в стерильные плоские сосуды и закрывали ватными пробками. Поверхность питательного раствора была сравнительно невелика. Микроорганизмы, вырабатывавшие антибиотики, находились на поверхности раствора, где больше всего было кислорода, выделяя продукты обмена веществ в питательный раствор. В связи с малыми выходами антибиотиков, большими затратами труда и большой потребностью в площадях вскоре перешли к ныне общепринятым глубинным культурам. Ферментативные процессы происходят в танках, или ферментерах. Благодаря продуванию стерильного воздуха и перемешиванию питательная среда непрерывно хорошо аэрируется, так что продуценты развиваются во всей толще питательной среды. Резервуары для промышленного производства антибиотиков изготовляют из нержавеющей стали полезной емкостью до 300 м3. Ферментеры стерилизуют перегретым водяным паром или газообразным формалином. Питательные среды при подаче в ферментер стерилизуют и доводят до нужной температуры. Питательные среды можно стерилизовать непосредственно в малых ферментерах путем нагревания водяным паром под давлением. Выращивание посевного (прививочного) материала начинают с посева спор агаровой культуры штамма-продуцента на предварительную среду; выращивание ведут на качалках. Полученный материал используют для засева в предварительную среду, находящуюся в более крупных сосудах на качалках или в малых ферментерах. среды. Среды для получения посевного материала и ферментации антибиотиков различаются как в качественном, так и в количественном отношениях. Питательную предварительную среду готовят с расчетом обеспечения хорошего роста мицелия и индукции ферментных систем, необходимых для последующего синтеза антибиотиков. Основная питательная среда должна обеспечивать прежде всего максимальный выход продукта. После засева основной среды происходит быстрое размножение микроорганизмов продуцента без сопутствующего образования существенного количества антибиотика (тро- фофаза). Затем размножение и рост клеток приостанавливаются, а в процессе обмена веществ образуются вторичные метаболиты (идиофаза). На этой стадии концентрация антибиотика в культуральной жидкости увеличивается, причем скорость этого процесса зависит от природы антибиотика. При несвоевременной остановке ферментации концентрация антибиотика в культуральной среде может снизиться вследствие гидролитических процессов (4.4). В ферментерах периодически проверяют концентрацию антибиотиков (см. 4.1.7), стерильность и другие физиологические параметры. После достижения требуемой биологической активности ферментацию прекращают, а культуральную жидкость направляют на химическую обработку для получения активного продукта (см. 4.1.8.2). Микроорганизмы, выделенные из природных субстратов, как правило, характеризуются слабой способностью синтезировать антибиотики. Увеличение выхода активного продукта в производственных условиях достигается селекцией продуктивных штаммов микроорганизмов-продуцентов, а также оптимизацией условий ферментации. Важнейший фактор оптимизации условий ферментации — это подбор подходящих питательпых сред для наращивания продуктивного штамма и для самой ферментации. Требования различных продуцентов антибиотиков к количественному и качественному составу питательных сред неодинаковы. Но в принципе любая питательная среда должна содержать хотя бы один источник углерода, один источник азота, а также неорганические соли и вещества с буферными свойствами. В исследовательских работах по ферментациям часто применяют синтетические питательные среды известного состава. В микробиологической же промышленности по экономическим соображениям применяются также сложные питательные среды. Так, в питательные среды включают такие природные вещества, как растительные полисахариды, жиры и масла, сухие дрожжи и даже отходы различных производств (меласса, соевый шрот, вода, в которой замачивалась кукуруза). Для того чтобы не было перебоев в работе, состав добавок должен быть однородным, они не должны содержать вредных примесей — тяжелых металлов, сульфитов и т. п. Наиболее благоприятный состав питательной среды обычно устанавливают эмпирически, путем качественного и количественного изменения состава компонентов, применяя при этом соответствующие способы оптимизации процесса. Исследования проводятся сначала в лабораторном масштабе. Испытуемые питательные среды находятся в колбах. После стерилизации и засева проводят инкубацию на качалках (для лучшей аэрации). Оптимальные питательные среды затем проверяют па полупроизводственных установках (от 10 до 4000 л). При благоприятных результатах среды используют в промышленной ферментации. Выход антибиотиков при ферментации можно значительно увеличить внесением в питательную среду предшественников, т. е. веществ, химическое строение которых идентично какой-либо части молекулы соответствующего антибиотика. Предшественники могут быть использованы и в качестве промежуточных соединений при синтезе антибиотика. Важными предшественниками для биосинтеза пенициллина G (бензилпенициллин) являются фенилуксусная кислота и ее производные, а для синтеза эритромицина, гризеофульвина п других антибиотиков — н-пропанол и пролионовая кислота. Ход ферментации зависит от температуры. Для ферментации со стрептомицетами благоприятная температура находится в пределах 28—30°С, для грибов — около 24°С, для бактерий - 35—37°С, Регулирующее действие на биосинтез антибиотиков оказывает рH среды. В начале ферментации вследствие расщепления углеводов до углекислоты и органических кислот цикла Кребса происходит значительное подкисление среды, компенсируемое добавкой порций карбоната кальция в питательную среду. Азотистые компоненты питательной среды расщепляются медленнее; выделяющиеся аммиак и другие соединения азота имеют щелочную реакцию, что приводит к сдвигу рН среды в щелочную область (4.4). Добавлением разбавленных растворов минеральных кислот или физиологически кислых солеи необходимо поддерживать рH на уровне, оптимальном для образования антибиотика (чаще всего это РН7). Рост аэробных продуцентов антибиотиков и их синтезирующая способность зависят от аэрации культуральной жидкости. В качал очных культурах наружный воздух диффундирует в культуральную жидкость, поверхность которой значительно увеличивается благодаря вращательно- му или возвратно-поступательному движению. В ферментеры подают стерильный воздух. Для лучшего распределения воздуха, поступающего в культуральную жидкость через узкие,, расположенные кольцами отверстия, в ферментере предусматривают сильную мешалку. Важную роль играет селекция высокопродуктивных штаммов соответствующего продуцента антибиотика. Предпосылка успеха такого рода работ заключается в скачкообразных генетических изменениях у отдельных особей популяции. Такие изменения называют мутациями, а организмы с измененной генетической информацией — мутантами. Увеличение антибиотической активности селектируемого мутантного штамма может обусловливаться непосредственным изменением информации полигенно контролируемого образования антибиотиков. Устойчивое усиление синтеза возможно также в результате мутации тех генов, которые определяют проницаемость клеточной оболочки, использование питательных веществ клетками продуцента и т. д. Спонтанные мутации происходят очень редко, и частота их у разных организмов по различным признакам неодинакова. Естественно, перспективы отбора спонтанных мутантов с высокой биосинтетической продуктивностью ограничены. На отборе мутантов основана так называемая поддерживающая селекция, В технической микробиологии она применяется для сохранения основных качественных и количественных характеристик продуктивного штамма. Для получения продуктивных штаммов продуцентов антибиотиков воздействуют на микроорганизмы или суспензии спор мутагенами — агентами, вызывающими мутации. В результате такой обработки резко увеличиваются частота мутаций, широта изменчивости популяции, создаются условия для отбора. Механизм действия мутагенов основан на прямых или косвенных изменениях генетической информации, т. е. на химических модификациях ДНК, касающихся последовательности оснований. Большей частью мутагены оказывают вредное воздействие па микроорганизмы, могут привести к их гибели. Существуют физические мутагены (ультрафиолетовые и ионизирующие излучения, ультразвук, перегрев) и химические мутагены (алкилирующие агенты, антиметаболиты, перекисные соединения, основные красители и др.). Несмотря па разнообразие мутагенов, невозможно обеспечить направленные мутации, которые существенно облегчили бы селекцию. У парасексуальных организмов, например у бактерий и стрептомицетов, генетический материал можно переносить путем трансформации, трансдукции и рекомбинации [108]. Такие воздействия играют все большую роль в технической микробиологии. Основная трудность селекционной работы заключается в обнаружении мутантов с требуемыми свойствами. К сожалению, очень редко существует корреляция между целью селекции и легко заметными внешними признаками организма, например формой роста, видом колоний, образованием пигмента и др. Результаты селекции микроорганизмов, образующих антибиотики, в большинстве случаев оцениваются только по антибиотической активности в глубинных культурах, для определения которой требуется много труда и времени. Химическое выделение Успех химического выделения антибиотика из культуральной жидкости всецело определяется его физико-химическими свойствами. В связи с разнообразием химического строения, неодинаковой растворимостью и разной стабильностью природных антибиотических веществ разработаны различные способы их выделения и очистки. Подробно эти способы описаны в специальных руководствах [14, 15, 48, 70, 71, 97, 109]. Чаще всего для выделения антибиотиков применяют экстракцию органическими растворителями, которые по смешиваются или плохо смешиваются с водой. В крупном производстве сейчас в основном применяют многоэтапное нротивоточпое распределение. В зависимости от распределения антибиотического вещества — равномерно между компонентами культурального материала или преимущественно в мицелии пли водной среде (фильтрат культуральной жидкости) — обрабатывают культуральную жидкость различно. Например, для получения гризеофульвина, актиномицинов ее обрабатывают целиком, а для получения нистатина отделяют мицелий, для получения пенициллина — только свободный от мицелия фильтрат. Чтобы получить антибиотики из растительных или животных тканей, последние топко измельчают. Экстрагирование проводят из свежего или высушенного материала преимущественно смешивающимися с водой органическими растворителями (низшие спирты, кетоны). Антибиотики с ионными свойствами, например основные стрептомицин и наромомицин, можно выделять из фильтратов культуральной жидкости путем адсорбции па ионообменниках. После элюции(удаления) активного вещества с адсорбента получают неочищенный концентрат. Антибиотики из культурального фильтрата можно выделять осаждением веществами, образующими нерастворимые соединения. Так, при производственном получении окситетрациклина антибиотики осаждают четвертичными азотистыми основаниями с длинной цепью, а также ионами кальция или магния. Осадок собирают, промывают, а затем разлагают соляной кислотой, причем образуется кристаллизуемый гидрохлорид окситетрациклина. Сырые концентраты или вещества для получения чистых препаратов должны быть освобождены от примесей. Этого обычно достигают различными методами хроматографии, повторным осаждением, высаливанием и перекристаллизацией. Термоустойчивые антибиотики очищают также перегонкой (например, элайомицин) или возгонкой (например, стрептоцин). Степень чистоты препарата антибиотика характеризуется обычно биологической активностью па единицу массы, т. е. числом единиц активности на миллиграмм препарата. 4.1.6.3. Химический синтез В результате интенсивных поисков путей химического производства антибиотиков удалось синтезировать лишь хлорамфеникол; в настоящее время в продажу поступает преимущественно синтетический препарат. Различные способы химического синтеза описали Маргрейтер и Гапп [79]. Химический способ получения других антибиотиков имеет лишь научный интерес, потому что по экономичности оп значительно уступает методам биологического синтеза. В последнее время начали синтезировать пенициллин. 4.1.6.2. Все большее значение приобретают так называемые полусинтетические антибиотики, обладающие, как правило, очень хорошими терапевтическими свойствами. Их получают путем вторичных химических превращений антибиотиков, выделенных методом ферментации. Примером может служить группа пенициллинов. В основе строения пенициллинов лежит 6-аминоненициллановая кислота, которую получают в результате ферментативного расщепления биосинтетических пенициллинов (например, бензилпенициллина, феноксиметилпенициллина) или непосредственно при ферментации без предшественников. Химическим алкилированием 6-аминопенициллановой кислоты хлоридом кислоты с боковой цепью желаемой длины получены так называемые полусинтетические пенициллины, в том числе и такие, которые до сих пор не были получены при ферментациях. Некоторые представители этой большой и разнообразной группы антибиотиков имеют большое терапевтическое значение. Боковая цепь а-феноксипенициллина является производной а-оксипропионовой кислоты. Благодаря стойкости к кислотам и хорошему всасыванию в желудке и кишечнике этот антибиотик вполне пригоден для перорального введения. Полусинтетический 2,6-диметоксифенилпенициллин менее активен по отношению к стафилококкам, чем бензилпенициллин, но значительно более устойчив к пенициллипазе. Путем введения а- аминофенилуксусной кислоты получают а-аминофенилпенициллин, который обладает высокой активностью также по отношению к грам-отрицательным бактериям (широкий спектр действия).

 

 

Способы получения антибиотиков

В настоящее время различают три способа получения антибиотиков: биологический, метод получения полусинтетических препаратов и синтез химических соединений — аналогов природных антибиотиков. 1. Биологический синтез. Одним из главных условий получения антибиотика в большом количестве является продуктивность штамма, поэтому используются наиболее продуктивные мутанты «диких штаммов», полученные методом химического мутагенеза. Продуцент выращивают в жидкой оптимальной среде, в которую и поступают продукты метаболизма, обладающие антибиотическими свойствами. Антибиотики, находящиеся в жидкости, выделяют, используя ионообменные процессы, экстракцию или растворители. Определение активности антибиотика в основном производится микробиологическими методами с использованием чувствительных тест-микробов. За Международную единицу активности антибиотика (ЕД) принимают специфическую активность, содержащуюся в 1 мкг чистого препарата пенициллина Международная единица активности равна 0,6 мкг. 2.Полусинтетические антибиотики. Их готовят комбинированным способом: методом биологического синтеза получают основное ядро молекулы нативного антибиотика, а методом химического синтеза, путем частичного изменения химической структуры — полусинтетические препараты. Большим достижением является разработка метода получения полусинтетических пенициллинов. Методом биологического синтеза было извлечено ядро молекулы пенициллина — 6-аминопенициллановая кислота (6-АПК), которая обладала слабой антимикробной активностью. Путем присоединения к молекуле 6-АПК бензильной группы создан бензилпенициллин, который теперь получают и методом биологического синтеза. Широко применяемый в медицине под названием пенициллин, бензилпенициллин обладает сильной химиотерапевтической активностью, но активен лишь в отношении грамположительных микробов и не действует на, устойчивые микроорганизмы, особенно стафилококки, образующие фермент — р-лактамазу. Бензилпенициллин быстро теряет свою активность в кислой и щелочной средах, поэтому его нельзя применять перорально (он разрушается в желудочно-кишечном тракте). Другие полусинтетические пенициллины: метициллин (Meticillin) — применяется для лечения инфекций, вызванных устойчивыми к бензилпенициллину стафилококками, так как не разрушается под действием фермента — (3-лактамазы; оксациллин (Oxacillin) — устойчив к кислой среде, поэтому его можно применять внутрь; ампициллин — задерживает размножение не только грамположительных, но и грамотрицательных бактерий (возбудителей брюшного тифа, дизентерии и др.). Полусинтетические препараты получают также на основе 7-аминоцефалоспориновой кислоты (7-АЦК). Производные 7-АЦК: цефалотин (Cefalotin), цефалоридин (Сеfaloridinum) не дают аллергических реакций у лиц, чувствительных к пенициллину. Получены и другие полусинтетические антибиотики, например рифампицин (Rifampicinum) — эффективный противотуберкулезный препарат. 3. Синтетические антибиотики. Изучение химической структуры антибиотиков дало возможность получать их методом химического синтеза. Одним из первых антибиотиков, полученных таким методом, был левомицетин. Большие успехи в развитии, химии привели к созданию антибиотиков с направленно измененными свойствами, обладающих пролонгированным действием, активных в отношении устойчивых к пенициллину стафилококков. К пролонгированным препаратам относятся экмоновоциллин (Ecmonovocillinum), бициллин 1,3,5. По спектру действия все антибиотики принято классифицировать на антибактериальные, антигрибковые и противоопухолевые. Антибактериальные антибиотики угнетают развитие бактерий. Существуют антибиотики узкого спектра действия, которые угнетают рост только грамположительных или грамотрицательных бактерий (например, полимиксин против Гр «-» флоры,оказывают бактерицидное действие (Polymyxin) и др.), и антибиотики широкого спектра, которые угнетают рост как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. К антибиотикам широкого спектра относятся беталактамиды, составляющие группу, в которую входят пенициллины и цефалоспорины. Основу молекул этих антибиотиков составляет бета-лактамное кольцо. Они обладают следующими свойствами: бактерицидный тип действия, высокая токсичность в отношении грамположительных микробов, быстрое наступление антибактериального эффекта и хорошая переносимость макроорганизмом, даже при длительном применении. В эту группу входят биосинтетические пенициллины, полусинтетические пенициллины, действующие на грамположительные микробы, и полусинтетические пенициллины и цефалоспорины с широким спектром действия. Тетрациклины — группа антибиотиков широкого спектра действия, в которую входят природные антибиотики (тетрациклин, окситетрациклин и др.) и их полусинтетические производные.

 

 

Производство пенициллина

Пенициллин был открыт в 1929 г. Александром Флемингом и был выделен в кристаллическом виде 1940 году. Установлено, что пенициллин оказывает антимикробное действие в отношении некоторых грамположительных бактерий (стафиллококков, стрептококков, диплококков и некоторых других) и практически неактивен в отношении грамотрицательных видов и дрожжей.

Способность образовывать пенициллин широко распространена среди многих плесневых грибов, относящихся к родам Penicillium и Aspergillus. Однако это свойство более характерно для группы Penicillium notatum-chrysogenum. Первые выделенные из естественных субстратов штаммы как наиболее активные продуценты пенициллина образовывали не более 20 единиц (12 мкг) антибиотика на 1 мл культуральной жидкости. В результате широкой научной работы по селекции новых активных штаммов продуцентов пенициллина получены различные штаммы Penicilliumchrysogenum, которые, в отличие от исходных штаммов, обладают высокой продуктивностью и используются в промышленности. В настоящее время в промышленных условиях получают культуральные жидкости с содержанием пенициллина более 15000 ед/мл, а отдельные штаммы способны синтезировать антибиотик в количестве до 25 тыс. ед/мл.

Под названием «пенициллин» объединена обширная группа веществ, которые являются N-ацильными производными гетероциклической аминокислоты. Из природных пенициллинов применяются бензилпенициллин и феноксиметилпенициллин.

 

Подготовка инокулята

Подготовка посевного материала включает следующие стадии:

1) выращивание посевного мицелия 1-й генерации в аппаратах малой емкости (инокуляторах);

2) выращивание посевного мицелия 2-й генерации в аппаратах большой емкости.

Споровая культура, используемая для засева инокулятора, выращивается на пшене в стеклянных флаконах, высушивается и в таком виде хранится при комнатной температуре. Засев производят сухими спорами из 2-3 флаконов.

Основной задачей при культивировании продуцента пенициллина в посевных аппаратах на стадии подготовки инокулята является быстрое получение большой массы мицелия, способного обеспечить при пересеве в ферментер интенсивный рост и высокий выход антибиотика. Для осуществления этой задачи продуцент необходимо выращивать на средах, богатых легкоусвояемыми питательными веществами, в условиях хорошей аэрации, при оптимальной для роста микроорганизма температуре.

В качестве легкоусвояемого углерода выступает глюкоза, сахароза и т.д. В качестве второго источника углерода применяют в небольших количествах лактозу, присутствие которой в среде для выращивания посевного мицелия желательно по следующей причине: ее потребление начинается не сразу, а после некоторого периода адаптации (привыкания), в течение которого происходит образование фермента, расщепляющего лактозу. Посевной мицелий, выращенный на среде, содержащей лактозу, обладает более высокой ферментативной активностью по отношению к трудноусвояемой лактозе и быстрее потребляет ее, что положительно сказывается на ходе ферментации.

Потребность гриба в азоте легко удовлетворяется минеральным азотом - аммонийным или нитратным. Помимо неорганического азота, в состав посевных сред, применяемых в промышленности, входит богатое органическим азотом растительное сырье типа кукурузного экстракта.Растительное сырье характеризуется не только наличием органического азота, оно содержит дополнительный углерод, входящий в состав аминокислот, полипептидов и белков, а также минеральные элементы, витамины и ростовые вещества.

Кроме углерода и азота, для роста микроорганизма необходимы фосфор, сера, магний, калий и микроэлементы – марганец, цинк, железо, медь. Большинство известных посевных сред содержит почти все вышеуказанные элементы, но в различных соотношениях. В таблице 1 приведен пример среды, применяемой для выращивания посевного материала.

Таблица 1 – Состав одной из сред для выращивания посевного материала.

Вещество	%
Кукурузный экстракт	2 (на сухой вес)
Глюкоза
Лактоза	0,5
Азотнокислый аммоний	0,125
Однозамещенный фосфорнокислый калий	0,2
Сернокислый магний	0,025
Сернокислый натрий	0,05
Мел	0,5

Существенное влияние на рост мицелия оказывает рН среды. Наиболее благоприятное значение рН для роста мицелия лежит между 6,0-6,5. При более кислом или более щелочном рН рост и развитие микроорганизма замедляются.

Выращивание посевного мицелия продолжается 36-50 часов до получения биомассы средней густоты. Мицелий, выращенный в инокуляторах, передается в количестве 10% по объему в посевные аппараты, где культивируется в течение 12-18 часов, а затем передается в большие ферментеры в количестве 15-20%. Процесс выращивания посевного мицелия 1-й и 2-й генерации осуществляется при температуре 24-26°.

Пенициллы - продуценты пенициллина являются типичными аэробами и требуют для своего роста и развития наличия кислорода. Для получения высокопродуктивного посевного мицелия наряду с оптимальной питательной средой необходимо обеспечить и достаточное снабжение гриба. В процессе производства пенициллина выращивание посевного мицелия осуществляют при непрерывном перемешивании и бесперебойной подаче воздуха в аппараты в количестве 1,2-1,5 объема воздуха на 1 объем среды в минуту.

Процесс ферментации

Ферментация является основной стадией в производстве пенициллина, на которой формируется целевой продукт. В промышленности применяется метод глубинной ферментации, при котором культура микроорганизма выращивается в питательной среде, заполняя весь ее объем. У различных штаммов потребность в источниках питания неодинакова. В связи с этим состав сред не является постоянным и универсальным для всех продуцентов, образующих пенициллин, и меняется с появлением новых штаммов.

Ферментационная среда должна быть составлена таким образом, чтобы развивающаяся культура, потребляя питательные вещества и выделяя продукты обмена, сама создавала необходимые условия и осуществляла переход от фазы роста мицелия к фазе пенициллинообразования. Желательно, чтобы вторая фаза была более продолжительной и чтобы процесс ферментации прекращался до наступления автолиза.

Для этого, как и при выращивании посевного материала необходимо одновременное присутствие в среде как легко-, так и трудноусвояемого углевода. Легкоусвояемый углевод обеспечивает быстрый рост и образование обильной биомассы; трудноусвояемый углевод создает условия, благоприятные для биосинтеза антибиотика.

При промышленном биосинтезе пенициллина наибольшее распространение в качестве легкоусвояемого углевода получила глюкоза или гидрол. Трудноусвояемым углеводом является лактоза. Лактоза является единственным углеводом, обеспечивающим полноценное протекание фазы пенициллинообразования. Высокий выход антитибиотика получают только при наличии в среде лактозыв качестве основного источника углевода. Лактоза находится в культуральной жидкости на протяжении всего процесса ферментации, благодаря чему мицелий обеспечен сахаром, биомасса в течение пенициллинообразования медленно растет, и накопление антибиотика достигает максимального уровня.

В состав ферментационных сред входит органический и минеральный азот. Отличным источником органического азота считается кукурузный экстракт, но он может быть с успехом заменен пшеничным экстрактом, различными жмыхами, соевой мукой, глютеном и другим растительным сырьем, богатым азотом.

Источником минерального азота обычно служат нитрат аммония, сернокислый аммоний и некоторые другие соли. При ассимиляции грибом аммонийного азота этих солей освобождаются анионы кислот, которые способствуют некоторому закислению среды.

Исключительно важную роль в обмене веществ клетки играет фосфор, который необходим не только для нормального роста и развития гриба, но и для осуществления самого процесса биосинтеза пенициллина. Для образования пенициллина требуется значительно более высокая концентрация фосфора в среде, чем для роста гриба.

Обязательным компонентом ферментационной среды является сера, входящая в состав важнейших аминокислот и ферментов. Сера необходима еще и потому, что она входит в состав молекулы пенициллина. В питательные среды сера вносится в виде солей серной кислоты и гипосульфита.

Из других элементов, необходимых для нормальной жизнедеятельности гриба и образования антибиотика, следует отметить калий, магний, цинк, железо, марганец, медь.

Также необходимо присутствие предшественников в среде. Предшественниками называются вещества, непосредственно включающиеся в молекулу получаемого продукта. Предшественником бензилпенициллина является фенилуксусная кислота (ФУК) или ее производные - фенилацетамид (ФАА), фенилэтиламин, фенилацетилглицин и другие вещества. Предшественником феноксиметилпенициллина является феноксиуксусная кислота (ФОУК). Оптимальная концентрация предшественника в среде устанавливается в зависимости от эффективности его использования для биосинтеза пенициллина данным штаммом.

Для биосинтеза пенициллина наиболее благоприятно нейтральное значение рН. Для поддержания в культуральной жидкости определенного уровня рН рекомендуется регулировать его с помощью автоматического добавления кислоты или щелочи либо путем установления правильного соотношения компонентов среды. В синтетических средах в качестве регуляторов рН чаще всего применяют органические кислоты, в комплексных средах - мел. Своеобразным регулятором рН при промышленном получении пенициллина является кашалотовый жир, который добавляется в среду в процессе ферментации как пеногаситель.

Для получения максимального выхода пенициллина основные компоненты среды должны входить в ее состав в строго определенных соотношениях и концентрациях. Состав некоторых сред, применяемых в производстве пенициллина представлен в таблице 2.

 

Таблица 2 – Состав сред, применяемых для получения пенициллина

Компоненты	Среда
кукурузная	жмыховая	жировая
Кукурузный экстракт	2,0 – 3,0	-	2,0 – 3,0
Жмыхи (арахисовый, подсолнечный, соевый и др.)	-	2,0 – 4,0	-
Лактоза	5,0	5,0	1,0
Глюкоза или гидрол	1,5	1,5	1,5
Кашалотовый жир или растительные масла	0,5 – 0,1	0,5 – 0,1	2,5 – 3,5
Азотнокислый аммоний	0,4	0,4	0,4
Сернокислый натрий	0,05	0,05	0,05
Фосфорнокислый калий однозамещенный	0,4	0,4	0,4
Сернокислый магний	0,025	0,025	0,025
Серноватистокислыый натрий (гипосульфит)	0,2	0,2	0,2
Мел	0,5 – 1,0	0,5 – 1,0	0,5 – 1,0
Предшественник	0,3 – 0,4	0,3 – 0,4	0,3 – 0,4

Основными показателями, свидетельствующими об окончании ферментации, являются полное исчезновение углеводов в культуральной жидкости и прекращение биосинтеза антибиотика. Процесс ферментации в производственных условиях осуществляется при температуре 26±1⁰ С и продолжается обычно 120-125 часов.

Интенсивность биосинтеза пенициллина зависит от количества мицелия, образуемого в процессе ферментации. Большая биомасса образует больше пенициллина, поэтому содержание углеводов, азота, фосфора и серы в среде должно быть достаточно высоким, чтобы обеспечить максимальное образование мицелия. Однако большая биомасса еще не гарантирует высокого выхода антибиотика. Гриб необходимо обеспечить не только достаточным количеством питательных веществ, но и необходимым количеством кислорода. Питание гриба и аэрация являются двумя сторонами одного процесса – чем больше питательных веществ в среде, тем больше требуется кислорода для их окисления. С другой стороны, повышение концентрации питательных веществ в среде ведет к увеличению биомассы, для дыхания которой требуется пропорционально большее количество кислорода. Состав питательной среды и аэрация взаимообусловлены. Максимальное количество пенициллина может быть получено только на средах с высокой концентрацией компонентов в условиях достаточного снабжения культуры растворенным кислородом.

Важным условием успешного проведения процесса биосинтеза пенициллина является строгое соблюдение условий асептики, так как попадание посторонних микроорганизмов может резко снизить выход антибиотика. Многие распространенные микроорганизмы способны образовывать фермент пенициллиназу, расщепляющий пенициллины. Попадание даже небольшого числа бактерий, способных вырабатывать пенициллиназу, приводит к полной инактивации пенициллина, в связи чемследует уделять особое внимание стерильности питательных сред, воздухаи вспомогательных материалов.

Необходимость обеспечения условий стерильности процессов при технологических связях агрегатов между собой коллекторными системами загрузки питательных сред, передачи посевного материала из инокуляторов в ферментаторы накладывает более высокие требования к уровню автоматизации этих процессов.

Фильтрация

Обычно для отделения мицелия от культуральной жидкости применяют вакуум-барабанные фильтры непрерывного действия. Фильтрацию начинают до начала автолиза мицелия, поскольку при фильтрации автолизированной культуры мицелий не образует плотной пленки на фильтрующей поверхности барабана, а налипает в виде отдельных тонких комков, которые сами не отходят в зоне «отдувки» фильтра, и их приходится удалять вручную. При этом продолжительность фильтрации увеличивается в 2 - 3 раза, выход фильтрата резко падает, а сам фильтрат получается очень мутным.

Необходимо тщательно соблюдать условия, препятствующие разрушению пенициллина во время фильтрации, - охлаждение нативного раствора до 4-6°С и систематическая (после каждой загрузки) обработка фильтра, коммуникаций и сборников антисептиками, например хлорамином. Фильтр также должен систематически стерилизоваться острым паром.

Предварительная обработка нативного раствора

Нативный раствор (фильтрат культуральной жидкости) представляет собой более или менее мутную, окрашенную в желто-коричневый или зеленовато-коричневый цвет жидкость. Величина рН среды в зависимости от штамма продуцента, состава среды и продолжительности процесса ферментации обычно колеблется от 6,2 до 8,2.

Очень важной характеристикой нативного раствора является содержание в нем белковых веществ, определяемых осаждением трихлоруксусной кислотой или другим соответствующим методом.

Применяется несколько способов предварительной обработки нативного раствора с целью освобождения от белковых примесей: осаждение солями многовалентных металлов (например, А1³⁺ Fе³⁺ или Zn²⁺), коагуляция танином, термическая коагуляция при температуре 60-75°С и рН 5,5 - 6,0, осаждение примесей катионными детергентами типа четвертичных аммониевых оснований (например, цетилпиридиний-бромидом или додецилтриметиламмонийхлоридом и т.п.). Применение этих методов приводит к потерям антибиотика. Обычно в результате коагуляции и последующей фильтрации или сепарирования теряется от 5 до 15%) пенициллина. При этом коагуляция солями металлов позволяет удалять не более 50% общего количества белковых веществ.

Отходы производства

Основные отходы, образующиеся в результате выделения и химической очистки антибиотиков, следующие: отработанные нативные растворы, водные маточные и промывные растворы, водные растворы кислот и щелочей после регенерации ионообменных смол, отработанный активированный уголь, кубовые остатки после регенерации растворителей. В этих отходах вредную долю составляют антибиотики и продукты их деструкции, а также органические растворители.

Принципиальные задачи совершенствования технологии получения антибиотиков из нативных растворов с точки зрения сокращения отходов производства заключаются в повышении выхода целевых продуктов и тем самым снижении потерь антибиотика, снижении расходов сырья на стадиях и повышении эф