Лабораторная работа по теме: «АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ»

Лабораторная работа по теме: «АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ»

Анализ аминокислотного состава белков при помощи цветных реакций.

В лабораторной практике для идентификации, полу количественного определения белков и отдельных аминокислот очень часто используются цветные реакции. В цветных реакциях происходит взаимодействие специфических реактивов с функциональными группами радикалов аминокислот, входящих в состав белков, или с пептидными группировками. Цветные реакции на белки проводят параллельно с растворами двух белков яичного белка (1) и желатина (2). Результаты оформляют в виде таблицы.

№ п/п	Реакция	Опреде­ляемая аминокис лота	Применяе­мые реактивы	Результаты реакции: наличие(+) или отсутствие (-)	Вывод. Сравнение аминокислота ого состава белков
				I	II
	Биуретовая
	Ксанто про­теиновая (нитрова­ния)
3 3	Миллона
	Фоля

Работа №1. Биуретовая реакция на белки

В щелочной среде раствор белка при добавлении разбавленного раствора сульфата меди окрашивается в сине-фиолетовый цвет. Окраска обусловлена образованием комплексов ионов меди с пептидными группами белка. Биуретовую реакцию дают все белки, а также олигопептиды, содержащие не менее двух пептидных связей.

Ход работы:

В одну пробирку наливают 5 капель раствора яичного бежа, в другую-5 капель раствора желатина. В каждую пробирку добавляют по 5 капель 10% раствора NaOH и по 1 капле 1 % раствора CuS0₄. В обеих пробирках наблюдают устойчивое сине-фиолетовое окрашивание. Оформление работы. Результаты опыта вносят в таблицу.

 

Рабата №2. Реакция на ароматические аминокислоты (реакция нитрования).

При нагревании с крепкой азотной кислотой растворы белка окрашиваются в желтый цвет Реакция обусловлена наличием в белках циклических аминокислот: фенил аланина, тирозина, триптофана - и основана на образовании нитропроизводных этих аминокислот:

 

 

После подщелачивания раствором NH4OH желтое окрашивание переходит в оранжевое (образуются аммонийные соли хиноидной структуры). Реакцию с азотной кислотой дают почти все белки, за исключением тех, в которых отсутствуют перечисленные аминокислоты.

Ход работы: В одну пробирку наливают 5 капель раствора яичного белка, во вторую – 5 капель раствора желатина. В обе пробирки добавляют по 3-5 капель концентрированный азотной кислоты и нагревают. В первый пробирке образуется белый осадок, который при нагревании окрашивается в желтый цвет и постепенно растворяется (происходит гидролиз белка), при этом раствор приобретает желтую окраску. Пробирки охлаждают, к охлажденному раствору добавляют (осторожно!) по 10 капель концентрированного раствора аммиака или 30% раствора гидроксида натрия и наблюдают изменение окраски растворов вследствие образования аммонийной соли динитротирозина. Результаты опыта вносят в таблицу.

Образование желтых пятен на коже при попадании азотной кислоты обусловлено этой реакцией.

 

Работа №3. Реакция на тирозин (реакция Миллона)

Реакция обусловлена наличием в белках аминокислоты тирозина. При нагревании или продолжительном стоянии раствора белка с реактивом Миллона (раствор нитратов ртути (1) и (2) в HNO₃ с примесью HNO₂) образуется осадок, окрашенный сначала в розовый, а затем в кроваво-красный цвет. Реактив Миллона дает окрашивание почти со всеми фенолами.

Ход работы:

В 3 пробирки наливают по 5капель: в 1-ю - раствора яичного белка, во 2-ю -раствора желатина, в 3-ю - раствора тирозина. Во все пробирки добавляют пo 2-3 капли реактива Миллона и осторожно нагревают. Наблюдают изменение окраски растворов и записывают в таблицу.

 

Практическая часть

Лабораторная работа по теме «БЕЛКИ»

 

Опыт№1: «ДИАЛИЗ БЕЛКОВ»

Диализ демонстрирует макромолекулярную природу белка. Как и все высокомолекулярные соединения, белок не проникает через искусственные (например, целлонам, пергамент и др.) и биологические мембраны, что позволяет использовать диализ как метод очистки белка от низкомолекулярных органических и неорганических примесей.

Метод основан на способности мембран задерживать макромолекулы белка и пропускать неорганические ионы.

Для приготовления раствора одну из смесей растворяют в 10 мг 50%-ного раствора муравьиной кислоты или в 10 мг дистиллированной волы, к которой добавляют несколько капель бутилового спирта.

Чтобы приготовить растворитель берут 4 части бутилового спирта, одну* часть ледяной уксусной кислоты и 5 частей дистиллированной волы жидкости наливают в делительную воронку, встряхивают в течение нескольких минут и оставляет для разделения слоев. Нижний олой сливают и используют для насыщения его парами камеры, в которой производится хроматография. Верхний насыщенный. водой бутилово-уксусньш слой, используют для хроматографии.

На дно хроматографической камеры наливают небольшое количество растворителя, который при испарении насыщает камеру парами, что предотвращает высыхание фильтровальной бумаги. В верхней части камера укрепляют ванночку, представляющей собой стеклянную трубку соответствующую длине камеры, запаянную с концов, имеющую продольный разрез шириной 2-3 мм, и наливают в нее растворитель.

Берут полоску хрономатографической бумаги шириной 5 см и, отступая от ее края на 8-10 см, при помощи микропипетки наносят 0,005-0,01 мл приготовленной смеси аминокислот. Образовавшееся пятно быстро просушивают над электроплиткой. Коней бумаги, ближе к которому нанесена капля смеси, опускают в ванночку с растворителем, а второй конец должен свободно свисать через отверстие в ванночке в камеру. Необходимо следить, чтобы полоска бумаги свисала строго вертикально и не прикасалась свободной концом ни к стенкам, ни ко дну камеры, ни к растворителю на дне камеры. В ванночке полоса бумаги фиксируется предметным стеклом или стеклянной палочкой.

В процессе хроматографии растворитель должен пройти вдоль всей полосы бумаги, увлекая за собой аминокислоты. Когда растворитель пройдет до конца полосы, ее извлекают из камеры и высушивают на воздухе в вытяжном шкафу. Для лучшего разделения смеси пропускание растворителя можно повторить. Высушенную полосу опрыскивают раствором 0,5%-ного нингидрина на ацетоне с добавлением уксусной кислоты и воды (95:1:4) и помещают в сушильный шкаф при температуре 60 °С на 10-15 чин. На высушенной полосе появляются отдельные лиловые пятна, соответствующие адсорбированныз аминокислот из взятой смеси.

 

 

Л абораторная работа по теме «БЕЛКИ»

Опыт №1:«ДИАЛИЗ БЕЛКОВ»

Диализ демонстрирует макромолекулярную природу белка. Как и все высокомолекулярные соединения, белок не проникает через искусственные (например, целлонам, пергамент и др.) и биологические мембраны, что позволяет использовать диализ как метод очистки белка от низкомолекулярных органических и неорганических примесей.

Метод основан на способности мембран задерживать макромолекулы белка и пропускать неорганические ионы.

Ход определения:

В две пробирки наливают по 1 -2 мл раствора яичного белка с хлоридом натрия. В первую пробирку добавляют 1-2 капли раствора азотнокислого серебра AgN0₃, во вторую - 2 мл NaOH и 1 -2 капли CuS0₄ (т.е. проделывают биуретовую реакцию качественную реакцию на пептидную связь в мо­лекулах белка).

Целлофану, предварительно замоченному в дистиллированной воде, придают форму мешочка, который примерно на 1/3 заполняют исследуемым раствором белка. Края мешочка зажимают "между двумя стеклянными палочками, которые прижимают друг к другу с помощью надетых с двух концов резиновых палочек

Мешочек погружают в стакан с дистиллированной водой, положив зажимающие его стеклянные палочки на края стакана.

Через 45 мин. после начала диализа берут две пробы наружное жидкости. С одной из них проводят биуретовую реакцию на белок, с другой - реакцию на ион хлора, добавляя 2-3 капли AgNOa.

Проделывают пробы на белок и ион хлора с жидкостью внутри мешочка.

Определяемые компоненты	До диализа	После диализа
	внешняя жидкость	внутренняя жидкость	Внешняя жидкость	внутренняя жидкость
Белок
Ион СГ				■1

В выводах отметить, какое свойство белка демонстрирует метод диализа.

 

 

А -АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ

Под влиянием фермента амилазы слюны крахмал гидролизустся сначала до декстринов, затем до дисахарида — мальтозы и под действием фермента мальтозы — до глюкозы.

Крахмал образует — с иодом синее окрашивание, декстрины — разную окраску в зависимости от их сложности; амилодекстрины - фиолетовую, эритродекстрины - краснобурую, ахродекстрины - желто-бурую. Отсутствие окраски указывает на образование мальтозы или глюкозы.

ХОД РАБОТЫ, В три пробирки наливают по 5 мл 1 % раствора крахмала

В пробирку № 1 добавляет 2-3 мл предварительно прокипяченной слюны

В пробирку № 2 и №3добавляют 2-3 мл разбавленной, но непрокипяченной слюны. Перемешивают содержимое пробирок и ставят пробирки № I и № 2 в водяную баню при температуре 38-40 °С Пробирку №3 ставят в сосуд со льдом. Через 15 минут во все пробирки добавляют по 2-3 капли раствора йода в йодистом калии

Наблюдают изменение окраски и делают вывод

 

 

А-АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ

Изменение пространственного расположения активных участков молекулы фермента пол влиянием рН приводит к изменению активного центра фермента и изменению скорости ферментативной реакции

ХОД РАБОТЫ', В три пробирки наливают 0,2 М раствор двузамещенного фосфорнокислого натрия и 0,1 М раствор лимонной кислоты в соотношениях, указанных а таблице. Получают буферные растворы со значением рН - 4,0, 6,8, 10,0. В каждую пробирку добавляют по 5 ил 1% раствора крахмала и по I мл разбавленного раствора слюны в 5 раз Содержимое перемешивают и ставят в баню на 15 минут. Затем во все пробирки добавляют 1-2 капли йода в йодистом калии.

АМИЛАЗЫ

№ пробы	р 1Нр	Соль Na2HPO<0.2 М	Лимонная кислота С 6 Н8 О7, 0,1 М	Субстрат крахмала 1%	Фермент амилаза слюны 1-3	Цвет 1 иодной пробы
	44,0	0,38	0,62	5мл	1мл
	66,8	0,77	0,23	5мл	1мл
		1мл + 1капля NaOH 0,1н	-	5мл	1мл

 

ФОСФОЛИПИДЫ»

Куриного яйца

Понятие о лецитинах. Лецитины относятся к фосфоглицеридам (фосфатидилхолинам). При гидролизе лецитинов освобождается молекула глицерина, две молекулы жирных кислот (из которых одна является непредельной), молекулы фосфорной кислоты и азотистого основания холина.

Фосфорная кислота в молекуле лецитина соединена сложноэфирной связью со спиртовой группой холина

холин

 

В зависимости от того, к какому углеродному атому глицерина присоединен остаток холинфосфорной кислоты, выделяют а и р-лецитины. Лецитины различаются также по жирным кислотам, входящим в их состав.

Реактивы: 1) желток куриного яйца, б) этиловый спирт, в) ацетон, г) хлористый кадмий, насыщенный спиртовой раствор.

Ход работы:

В небольшой стаканчик вносят желток куриного яйца и, помешивая стеклянной палочкой, добавляют 10 мл горячего спирта. После остывания содержимое фильтруют в сухую пробирку. Фильтрат должен быть прозрачным.

Осаждение ацетоном.

В сухую пробирку наливают 2-3 мл ацетона и по каплям прибавляют спиртовой раствор лецитинов. Выпадает осадок. Так как лецитины в ацетоне не растворяются.

Осаждение хлористым кадмием

В сухой пробирке к 1 мл спиртового каплям насыщенный раствор хлористого кадмия. Выпадает белый осадок соединения лецитинов с хлористым кадмием.

Обнаружение холина.

После осаждения ацетоном осадок лецитинов нагревают с несколькими мл 10%-ного раствора едкого кали или едкого нарта. Лецитины гидролизуются на свои компоненты. При гидролизе происходит частичный распад холина с отщеплением триметиламина, обладающего селедочным

запахом.

Приборы: Штатив с пробирками, спиртовка, воронки, фильтры.

Реактивы. Раствор желтка (161), едкий натр 10%-ный раствор, лакмусовая бумажка, соляная кислота 10%-ный раствор, сернокислая медь 5%-ный раствор, молибденовый реактив.

Ход работы: В пробирку поместить 2 мл раствора желтка добавить 2 мл едкого натрия и прокипятить. Идет гидролитический распад лецитина Наряду с гидролизом лецитина распадается холин с образованием триметиламина, который можно обнаружить по посинению влажной лакмусовой бумажки, поднесенной к пробирке.

Обнаружение жирных кислот.

К гидролизату добавить 10%-иый раствор соляной кислоты (до кислой реакции среды по лакмусовой бумажке). В кислой среде жирные кислоты — в виде хлопьев (в щелочной они находятся в виде растворимых натриевых солей). Жирные кислоты отфильтровать, а фильтрат* использовать для следующих двух опытов.

Обнаружение глицерина.

К одной части фильтрата добавить 10%-ный раствор едкого натрия (до щелочной реакции среды) и 5%-ный раствор сернокислой меди. Образуется ярко-синий осадок глицерата меди.

Лабораторная работа по теме: «АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ»

Анализ аминокислотного состава белков при помощи цветных реакций.

В лабораторной практике для идентификации, полу количественного определения белков и отдельных аминокислот очень часто используются цветные реакции. В цветных реакциях происходит взаимодействие специфических реактивов с функциональными группами радикалов аминокислот, входящих в состав белков, или с пептидными группировками. Цветные реакции на белки проводят параллельно с растворами двух белков яичного белка (1) и желатина (2). Результаты оформляют в виде таблицы.

№ п/п	Реакция	Опреде­ляемая аминокис лота	Применяе­мые реактивы	Результаты реакции: наличие(+) или отсутствие (-)	Вывод. Сравнение аминокислота ого состава белков
				I	II
	Биуретовая
	Ксанто про­теиновая (нитрова­ния)
3 3	Миллона
	Фоля